3.2.3. Вміст карбонільних груп білків

Зростання концентрації карбонільних груп білків (КБ) часто використовується як маркер оксидативних процесів спричинених активними формами кисню [Johansson et al., 2004; Lushchak, 2007].

У нашому експерименті рівень карбонільних груп білків був нижчий у рослин експонованих до НПН за всіх використаних концентрацій, порівняно з контрольним значенням (рис. 3.17).

Рис. 3.17. Концентрація карбонільних груп білків у листках проростків кукурудзи після 24 год експозиції з нітропрусидом натрію та фериціанідом калію (0,1, 0,5 та 1,0 мМ). *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з ФЦК та НПН) та ^#ФЦК груп з Р < 0,05 (n = 7-9).

Так, при 0,1 мМ концентрації НПН вміст КБ знижувався лише на 6-7%, тоді як вищі концентрації призводили до зниження даного показника на 16-31%. Подібна тенденція у вмісті КБ спостерігалась і у проростків, експонованих до ФЦК. Проте нітропрусид натрію в концентрації 1,0 мМ знижував концентрацію карбонільних груп білків не тільки в порівнянні з контрольною групою на 31%, а також відносно групи рослин, обробленої фериціанідом калію на 18%.

Отримані дані свідчать, що обидві використані речовини можуть пригнічувати окисні пошкодження білків у листках проростків кукурудзи. У випадку НПН такий ефект може бути зумовлений здатністю ^•NO сповільнювати окисні процеси, оскільки подібні результати захисної ролі оксиду азоту проти окисних пошкоджень, спричинених ультрафіолетовим випромінюванням, спостерігались у листках бобів [Shi et al., 2005]. Зниження окисних пошкоджень білків також було показано при додаванні 1 мМ НПН на рослинах сорго [Jasid et al., 2008]. Зниження концентрації карбонільних груп білків було отримано на листках A. thaliana в системі in vitro за дії 1 мМ НПН [Semchuk et al, 2011]. Щодо ФЦК, то механізми захисної ролі від окисних пошкоджень потребують подальших досліджень.

3.2.4. Активність ферментів

Ферментативна система антиоксидантного захисту запобігає окисним пошкодженням клітин рослини [Gill and Tuteja, 2010]. З літературних джерел також відомо, що екзогенна обробка рослин донорами ^•NO підвищує активність антиоксидантних ферментів, експресію відповідних генів і стимулює синтез ферментів de novo [Красиленко и др., 2010]. Зокрема, підвищення активності каталази та АПО під впливом донорів ^•NO спостерігалася у листках Stylosanthes guianensis [ Zhou et al., 2005], проростках рису [ Uchida et al, 2002; Hung et al., 2002] та у листках Citrus aurantium [Tanou et al., 2009].

Відомо, що каталаза належить до ферментів першої лінії захисту від АФК. При її дослідженні було показано, що при обробці листків проростків кукурудзи нітропрусидом натрію за всіх використаних концентрацій активність даного ферменту незмінювалась (рис. 3.18).

Рис. 3.18. Активність каталази у листках проростків кукурудзи після 24 год експозиції з нітропрусидом натрію та фериціанідом калію (0,1, 0,5 та 1,0 мМ). *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з ФЦК та НПН) та ^#ФЦК груп з Р < 0,05 (n = 7-9).

Проте, у проростків інкубованих з усіма використаними концентраціями ФЦК активність даного ферменту була вищою на 38-49%. Оскільки в активному центрі каталази знаходиться залізо, то можна припустити, що йони заліза, які входять до складу ФЦК, сприяють зростанню активності даного ферменту. Водночас, відсутність змін у активності каталази за дії НПН може свідчити про здатність ^•NO зв’язувати ці йони. Обробка проростків сої протягом 10 діб 0,2 мМ НПН також не призводила до зміни активності каталази [Kazemi et al., 2010]. На відміну від отриманих нами результатів, зростання активності каталази було виявлено у системі in vitro за обробки 0,1 мМ нітропрусидом натрію листків картоплі протягом 24 год [Beligni et al., 2002].

Активність аскорбатпероксидази була вищою на 60-61% у рослин, оброблених та 0,1 та 0,5 мМ НПН (рис. 3.19). Подібний ефект спостерігався і у випадку ФЦК. Зоктрема, активність АПО була вищою на 44-60% у проростках експонованих до всіх використаних концентрацій ФЦК.

Рис. 3.19. Активність аскорбатпероксидази у листках проростків кукурудзи після 24 год експозиції з нітропрусидом натрію та фериціанідом калію (0,1, 0,5 та 1,0 мМ). *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної групи (без інкубації з ФЦК та НПН) з Р < 0,05 (n = 7-9).

Раніше встановили, що обробка 0,2 мМ НПН протягом 10 днів призводила до зростання активності АПО у проростках сої [Kazemi et al., 2010]. Також зростання активності було отримано при обробці культури клітин тютюну 0,5 мМ НПН протягом 1-7 год обробки [de Pinto et al., 2002].

Гваяколпероксидаза також використовує пероксид водню як косубстрат для окислення різних сполук, зокрема фенолів, а також фермент може бути задіяний у відповіді на стрес. У наших експериментах, активність ГПО була нижчою у рослин, оброблених НПН на 45-69% (рис. 3.20). ФЦК також знижував активність даного ферменту на 71-80% порівняно з конролем. Проте, важливо зазначити, що інкубація листків проростків кукурудзи з нітропрусидом натрію значно менше знижувала даний показник. Оскільки ГПО є гем-вмісним ферментом, її активність може інгібуватися йонами CN^-. Вища активність ГПО у проростків інкубованих з НПН, ніж у проростків, інкубованих з ФЦК можна пояснити здатність ^•NO нівелювати токсичний вплив ціаніду.

Рис. 3.20. Активність гваяколпероксидази у листках проростків кукурудзи після 24 год експозиції з нітропрусидом натрію та фериціанідом калію (0,1, 0,5 та 1,0 мМ). *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з ФЦК та НПН) та ^#ФЦК груп з Р < 0,05 (n = 7-9).

Зниження активності ГПО було зареєстровано на сої при експозиції до 0,2 мМ НПН протягом 10 діб [Kazemi et al., 2010]. Важливо підкреслити, що ферменти, такі як каталаза, АПО та ГПО, в значній мірі залучені в регуляції не тільки рівня пероксиду водню, але й загального редокс статусу [Janssen-Heininger et al., 2008].

Підвищення активності антиоксидантних ферментів може свідчити про відповідь рослин на оксидативний стрес низької інтенсивності [Smirnoff, 1995; Lushchak, 2011]. Цікаво, що у листках проростків кукурудзи активність обох ферментів, каталази та аскорбатпероксидази, зростала при їх обробці ФЦК, в той час як інкубація з НПН призводила до зростання лише активності АПО.

Динаміка активності ГПО за дії сольового стресу була протилежною до каталази та АПО. Її активність знижувалась за експериментальних умов. Можливо, обидва використані ефектори призводять до легкого оксидативного стресу, який не викликає істотних окисних пошкоджень, тільки підвищує захисний потенціал організму.

Глютатіон є необхідним компонентом практично всіх живих організмів. Він може безпосередньо знешкоджувати активні форми кисню, або робити це виступаючи кофактором специфічних ферментів, які знешкоджують АФК. У зв’язку з цим, була визначена активність двох глютатіон-залежних ферментів – глютатіон-S-трансферази (ГSТ) та глютатіонредуктази (ГР).

Рис. 3.21. Активність глютатіон-S-трансферази у листках проростків кукурудзи після 24 год експозиції з нітропрусидом натрію та фериціанідом калію (0,1, 0,5 та 1,0 мМ). *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з ФЦК та НПН) та ^#ФЦК груп з Р < 0,05 (n = 7-9).

Активність ГSТ була вищою у рослин експонованих до 0,5 та 1,0 мМ НПН на 18 та 28% відповідно, порівняно з контрольним значенням (рис. 3.21). Фериціанід калію при концентраціях 0,1 та 0,5 мМ не впливав на активність ГSТ, тоді як 1,0 мМ ФЦК призводив до зростання активності даного ферменту на 12%.

Попередні дослідження показали, що ^•NO активує експресію ГSТ генів у рослин сої [Delledonne et al., 1998] та тютюну [Durner et al., 1998] за дії патогенів.

З рис. 3.22 видно, що активність глютатіонредуктази була вищою на 41-60% у листках проростків, експонованих до всіх використаних концентрацій нітропрусиду натрію порівняно з контрольними даними. Водночас, 0,1 та 1,0 мМ ФЦК також підвищував активність ГР у рослин.

Рис. 3.22. Активність глютатіонредуктази у листках проростків кукурудзи після 24 год експозиції з нітропрусидом натрію та фериціанідом калію (0,1, 0,5 та 1,0 мМ). *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з ФЦК та НПН) та ^#ФЦК груп з Р < 0,05 (n = 7-9).

Отримані дані добре узгоджуються з відомостями про антиоксидантну дію обох використаних ефекторів, НПН та ФЦК, на вільнорадикальні процеси у листках проростків кукурудзи. Проте, у випадку НПН даний ефект був більше виражений, ніж за дії ФЦК, що може бути зумовлене саме дією ^•NO. Попередньо було показано, що преінкубація проростків рису НПН протягом двох діб підвищувала активність ГР за дії стресових факторів [Uchida et al., 2002]. Обробка НПН також підвищувала активність глютатіонредуктази за дії сольового стресу в листках рослин лимону [Tanou et al., 2009]. Не впливала на активність глютатіонредуктази експозиція культури клітин тютюну до 0,5 мМ НПН протягом 1-7 год [de Pinto et al., 2002]. Описані літературні дані чітко показують, що обробка різних рослин нітропрусидом натрію або іншими донорами ^•NO, може підвищувати їх антиоксидантний потенціал через підвищення активності антиоксидантних ферментів.

3.2.5. Антиоксидантний потенціал

Антиоксидантний потенціал у рослин зумовлений наявністю у них низькомолекулярних гідрофільних та ліпофільних антиоксидантів, а також широким спектром антиоксидантних ферментів. Тому в даній роботі нами було досліджено антиоксидантний потенціал у жиророзчинній (спиртова екстракція) та водорозчинній (водній екстракція) фракціях у рослин, експонованих до нітропрусиду натрію та фериціаніду калію (таблиця 3.3).

У проростків, оброблених 0,1 мМ НПН, антиоксидантний потенціал у водній фракції був на 80% вищий, порівняно з контрольним значенням, тоді як інші концентрації НПН не впливали на даний параметр. Слід відмітити, що жодна з концентрацій ФЦК не змінювала даного показника, що підтверджує здатність нітропрусиду натрію за низьких концентрацій стимулювати загальний антиоксидантний захист.

Таблиця 3.3

Антиоксидантний потенціал (мкмоль тролокс/г св) у листках проростків кукурудзи після 24 год експозиції з нітропрусидом натрію та фериціанідом калію (0,1, 0,5 та 1,0 мМ)

	Контроль	0,1 мM	0,5 мM	1,0 мM
Водна екстракція
ФЦК	2,46 ± 0,29	2,08 ± 0,23	2,02 ± 0,21	2,18 ± 0,19
НПН		3,76 ± 0,47*	2,70 ± 0,48	2,90 ± 0,42
Спиртова екстракція
ФЦК	3,83 ± 0,38	3,42 ± 0,32	4,37 ± 0,29	3,92 ± 0,25
НПН		4,20 ± 0,30	3,73 ± 0,22	3,59 ± 0,29

Примітка. *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної групи (без інкубації з ФЦК та НПН) з Р < 0,05 (М ± m, n = 7-9).

Дані результати дозволяють зробити висновок, що нітропрусид натрію може підвищувати загальний антиоксидантний потенціал в проростках кукурудзи за рахунок водорозчинних антиоксидантів. Подібний ефект було знайдено за дії стресу, спричиненого кадмієм, у коренях проростків Medicago truncatula [Xu et al., 2010] та за дії осмотичного стресу в проростках пшениці [Tan et al., 2008].