2.7. Визначення вмісту тіолових сполук
Визначення концентрації загальних тіолів. Концентрацію загальних тіолів (суму концентрацій низько- і високомолекулярних тіолів) визначали в реакції з 5,5'-дитіобіс-2-нітробензойною кислотою (ДТНБ) [Ellman, 1959], використовуючи супернатанти, приготовлені у відповідності до процедури, описаної вище. Аліквоти супернатантів (50 мкл) додавали у пробу, яка містила (тут і надалі вказані кінцеві концентрації): 100 мМ КФБ (рН 8,0) та 0,05 мМ ДТНБ. Пробу, яка містила всі компоненти окрім супернатантів, використовували як контроль. Проби інкубували 30 хв при кімнатній температурі. Після інкубації визначали оптичне поглинання проб при довжині хвилі 412 нм на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина). Загальний вміст тіолових груп визначали за формулою (рівняння 2.9):
(2.9)
де SH - вміст тіолових груп в мкмоль/грам сирої ваги (г св);
∆D – різниця між оптичною густиною дослідної і контрольної проб;
Vпр – об’єм проби (1,5 мл);
ε412 – коефіцієнт молярної екстинції продукту взаємодії ДТНБ з тіоловими групами, що становить 14000 М-¹ см-¹;
nпреп – об’єм супернатанту, який відбирали для інкубації (в даному випадку становить 50 мкл);
l – довжина оптичного шляху променя світла;
11 – розведення при гомогенізації (1:10).
Визначення концентрації низько- і високомолекулярних тіолів. Для відділення низькомолекулярних тіолових сполук від високомолекулярних аліквоти супернатантів (70 мкл) змішували з 35 мкл 30% ТХО (кінцева концентрація ТХО 10%) та центрифугували (5 хв, 5000 g, центрифуга Епендорф 5415 R) для осадження білків. З отриманих супернатантів з ТХО відбирали 75 мкл, які вносили у проби, що містили 0,05 мМ ДТНБ і 100 мМ трис-НСl буфер (рН 9,0). При цьому рН реакційної суміші становило 8,0 аналогічно до рН суміші для визначення вмісту загальних тіолів. Контрольна проба містила ті ж компоненти, але замість супернатанту додавали 25 мкл 30% ТХО та 50 мкл середовища гомогенізації (50 мМ КФБ, 0,5 мМ ЕДТА). Розрахунки концентрації низькомолекулярних тіолів проводили з використанням формули, наведеної вище для загальних тіолів.
Вміст високомолекулярних тіолів розраховували за різницею між вмістом загальних і низькомолекулярних тіолів для кожної проби окремо [Lushchak and Bagnyukova, 2007].
2.8. Вивільнення оксиду азоту з нітропрусиду натрію
Кількість оксиду азоту, утвореного нітропрусидом натрію протягом 24 год, оцінювали непрямим методом з реактивом Гріса (розчин сульфанілової кислоти і α-нафтиламіну в розведеній оцтовій кислоті) [Privat et al., 1997]. Для побудови калібрувального графіка використовували розчин NaNO2 (0,25 мг NO2–/л). Інтенсивність забарвлення одержаних проб визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 536 нм на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина).
2.9. Загальний антиоксидантний потенціал
Визначення тролокс-еквівалентного антиоксидантного потенціалу (TEAП) проводили спектрофотометричним методом за допомогою повнопланшетного фотометра (Labsystems Multiskan MCC/340, Фінляндія) при 414 нм. Метод базується на спектрофотометричному визначенні генерації AБТС катіон-радикалу [2,29-азинобіс-(3-етилбензотіазолін-6-сульфонова кислота)], описаною Re та колегами [Re et al., 1999]. Використовували два типи екстрактів – водний та спиртовий. Для отримання водних екстрактів листки гомогенізували у фарфоровій ступці з 50 мМ КФБ (рН 7,0) у співвідношенні 1:10 (маса:об’єм). Процедуру проводили аналогічно для спиртового екстракту із заміною води на 96%. В обох випадках, екстракти центрифугували 15 хв, 16000 g на центрифузі Епендорф 5415 R (Німеччина). Тролокс (6-гідрокси-2,5,7,8-тетраметихроман-2-карбоксильна кислота) використовувався як антиоксидантний стандарт.