2.6. Визначення показників оксидативного стресу

Супернатанти (0,4 мл) змішували у співвідношенні 1:1 з 40% трихлороцтовою кислотою (ТХО) та центрифугували (5000 g, 5 хв, 4°C, центрифуга Епендорф 5415 R). Осад використовували для визначення концентрації карбонільних груп білків, а супернатант з ТХО – для визначення вмісту ТБК-активних продуктів.

Вміст карбонільних груп білків визначали з використанням динітрофенілгідразину (ДНФГ) [Лущак та ін., 2004]. Для кожного визначення готували одночасно дві проби: контрольну і дослідну. Осаджені, як описано вище, білки інкубували з 0,8 мл 10 мМ динітрофенілгідразином (ДНФГ) в 2 М HCl протягом 1 год при кімнатній температурі. Контрольні проби замість ДНФГ інкубували з 0,8 мл 2 М HCl. Після інкубації проби знову осаджували (10 хв, 5000 g, 21°С) і тричі промивали сумішшю (0,8 мл) етанол : етилацетат (1:1) для видалення незв’язаного ДНФГ. Після кожного промивання проби центрифугували в попередньому режимі, відкидаючи супернатанти. Отримані осади інкубували з 1,3 мл 6 М гуанідин-HCl протягом 30 хв для розчинення білків. Нерозчинені частинки осаджували на центрифузі Епендорф 5415 R (Німеччина) (15 хв, 132000 g, 21°С). Вміст утворених динітрофенілгідразонів визначали спектрофотометрично на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина) при 370 нм, реєструючи оптичну густину дослідної проби відносно контрольної. Для розрахунків використовували коефіцієнт молярного поглинання динітрофенілгідразонів 22 мМ^-1см^-1 [Лущак та ін., 2004]. Концентрацію карбонільних груп білків розраховували за наступною формулою (рівняння 2.7):

, (2.7)

де КБ – вміст карбонільних груп білків, нмоль/мг білка;

ОD_дослід – оптичне поглинання дослідної проби;

ОD_{контроль} – оптичне поглинання контрольної проби;

V_пр – об’єм гуанідинової проби, мл;

ε – коефіцієнт молярної екстинції динітрофенілгідразонів, 22000 М^-1см^-1;

[білок] – концентрація білка в гуанідиновій пробі (мг/мл).

Концентрація тіобарбітурат-активних продуктів. Малоновий диальдегід (продукт окислення ліпідів) взаємодіє з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) з утворенням так званих ТБК-активних продуктів (ТБКАП) [Dhindsa, 1981]. Супернатанти (1,5 мл), отримані після осадження білків ТХО, кількісно переносили в чисті пробірки і додавали 0,5% розчин тіобарбітурової кислоти в 20% ТХО у співвідношенні 1:1. Суміш інкубували протягом 30 хв на киплячій водяній бані у щільно закритих пробірках для уникнення випаровування проб. Після інкубації та охолодження проби кількісно переносили в епендорфи та центрифугували (5 хв, 8000 g, на центрифузі ОПН-8 (СРСР)). Поглиння визначали на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина) при довжині хвилі 532 нм. Неспецифічне поглинання проб визначали при 600 нм [Heath, 1968]. Вміст ТБКАП розраховували із використанням коефіцієнту молярної екстинкції ТБК2-МДА аддукту 155000 M^-1cм^-1 і виражали у нмоль/г сирої маси.

Вміст ТБКАП вираховували за формулою (рівняння 2.8):

, (2.8)

де ТБКАП – вміст ТБКАП, нмоль/г сирої маси;

ОD₅₃₂ – оптичне поглинання проби при λ 532 нм;

ОD₆₀₀ – оптичне поглинання проби при λ 600 нм;

V_пр – об’єм проби, мл;

Р – розведення, 11;

ε₅₃₂ – коефіцієнт молярної екстинції ТБК2-МДА аддукту, 155000 M^-1cм^-1;

V_суп – об’єм супернатанту, мл.