2.3. Визначення ростових параметрів

Довжину кореня і надземної частини проростків кукурудзи вимірювали за допомогою лінійки. Вагу кореневої системи та надземної частини визначали на електронній вазі (Sartorius 1212 МР, Germany).

2.4. Визначення концентрації пігментів

Листки проростків кукурудзи промивали дистильованою водою, промокали фільтрувальним папером і гомогенізували у фарфоровій ступці або гомогенізаторі Поттера з охолодженим 96% етанолом у присутності CaCO₃ (для попередження феофетинізації хлорофілів) у співвідношенні 1:10 (маса:об’єм). Гомогенати центрифугували (5 хв, 8000 g, 4°С) на центрифузі ОПН-8 (СРСР). Супернатанти відбирали в попередньо підготовлені пробірки. Осади тричі промивали 1 мл 96% етанолу, повторно центрифугували в попередньому режимі, щоразу об’єднуючи отримані супернатанти з першим. Кінцевий екстракт розводили 96% етанолом у 5 разів та визначали оптичне поглинання світла хлорофілом a, хлорофілом b та каротиноїдами на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина) при довжинах хвиль ₁ 664,2 нм, ₂ 648,6 нм, ₃ 470 нм, відповідно.

Концентрацію хлорофілу a, хлорофілу b, загального хлорофілу та каротиноїдів розраховували за формулами (рівняння 2.1-2.4.) [Lichtenthaler, 1987]:

C_a  = 13,36×OD_664,2 – 5,19×OD_648,6, (2.1)

C_b = 27,43×OD_648,6 – 8,12×OD_664,2, (2.2)

C_{a + b} = 5,24×OD_664,2 + 22,24×OD_648,6, (2.3)

C _{x + c} = (1000×OD₄₇₀ – 2,13×C_a – 97,64×C_b )/209, (2.4)

де C_a – концентрація хлорофілу a , мкг/мл;

C_b – концентрація хлорофілу b, мкг/ мл;

C_a+b – концентрація загального хлорофілу, мкг/мл;

C_x+c – концентрація каротиноїдів, мкг/ мл;

OD – оптичне поглинання проби при вказаній довжині хвилі.

Для перерахунку наведених концентрацій у мкМ на грам сирої ваги використовували молекулярні маси хлорофілу a (892 г/моль), хлорофілу b (906 г/моль), каротиноїдів (570 г/моль) [Gitelson et al., 2001].

Для визначення вмісту антоціанів до розведеного спиртового екстракту додавали 36% HCl до кінцевої концентрації 1%. Оптичне поглинання вимірювали на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина) при довжині хвилі 530 нм.

Концентрацію антоціанів обчислювали за наступною формулою (рівняння 2.5):

, (2.5)

де С_ант – концентрація антоціанів, мкмоль/мл;

OD₅₃₀ – оптичне поглинання проби при  530 нм;

₅₃₀ – коефіцієнт молярної екстинції антоціанів, 30 000 М^-1см^-1 [Gitelson et al., 2001].

2.5. Визначення активності ферментів та концентрації загального білка

Приготування супернатанту. Для визначення вмісту карбонільних груп білків, тіобарбітурат-активних продуктів, тіолових сполук та концентрації загального білка, а також активності антиоксидантних ферментів листки проростків кукурудзи гомогенізували в середовищі, яке містило 50 мМ калій-фосфатний буфер (КФБ), рН 7,0, 0,5 мМ етилендиамінтетраацетат (ЕДТА) та 1,0 мМ фенілметилсульфонілфторид. Співвідношення тканини до середовища гомогенізації становило 1:10 (маса:об’єм). Гомогенати центрифугували (10 хв, 13200 g, 4°С) на центрифузі Епендорф 5415 R (Німеччина). Після центругування осади відкидали і у подальших експериментах використовували супернатанти.

Активності ферментів визначали за відповідними для кожного ферменту методиками.

Активність каталази (EC 1.11.1.6) визначали при довжині хвилі 240 нм на спектрофотометрі СФ-46 (Ломо, СРСР) у пробі об’ємом 1,5 мл, яка містила 50 мМ КФБ (рН 7,0), 0,5 мМ ЕДТА, 10 мМ пероксиду водню і 10 мкл супернатанту. Реакцію починали додаванням пероксиду водню. Для розрахунку використовували коефіцієнт молярного поглинання 39,4 М^-1см^-1 пероксиду водню [Aebi, 1984].

Активність аскорбатпероксидази (АПО; EC 1.11.1.11) визначали спектрофотометрично на спектрофотометрі СФ-46 (Ломо, СРСР), реєструючи зниження оптичного поглинання через окислення аскорбату (АК) до дегідроаскорбату (ДГА) при довжині хвилі 290 нм (ε = 28000 М^-1 сm^-1) [Ali et al., 2005]. Проба (2 мл) містила 50 мМ КФБ (рН 7,0), 0,5 мМ ЕДТА, 50 мМ аскорбінову кислоту, 10 мМ пероксид водню та 50 мкл супернатанту. Реакцію починали додаванням пероксиду водню.

Активність гваяколпероксидази (ГПО, EC 1.11.1.7) визначали на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина) у пробі об’ємом 1,5 мл, реєструючи зміну оптичного поглинання внаслідок окислення гваяколу (монометиловий ефір пірокатехіну або 2-метоксифенол) до тетрагваяколу при довжині хвилі 470 нм [Ali et al., 2005]. Активність ферменту обчислювали з використанням коефіцієнту молярного поглинання тетрагваяколу 26600 М^-1см^-1 [Ali et al., 2005]. Суміш для визначення активності цього ферменту містила 50 мМ КФБ, (рН 7,0), 20 мМ гваякол, 8 мМ пероксид водню і 10 мкл супернатанту. Реакцію починали додаванням супернатанту.

Активність глютатіон-S-трансферази (ГST, EC 2.5.1.18) визначали реєструванням зміни оптичної густини внаслідок утворення адукту між відновленим глютатіоном (GSH) та 1-хлоро-2,4-динітробензеном (ХДНБ) при 340 нм (ε = 9600 М^-1 см^-1) [Lushchak et al., 2005]. Суміш для визначення активності містила 50 мМ КФБ, (рН 7,0), 0,5 мМ ЕДТА, 5 мМ GSH, 1 мМ ХДНБ та 100 мкл супернатанту. Реакцію починали додаванням супернатанту.

Активність глютатіонредуктази (ГР, EC 1.6.4.2) визначали спектрофотометрично на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина) реєструючи зміну оптичної густини внаслідок окислення НАДФН при довжині хвилі 340 нм [Halliwell and Foyer, 1978]. Проба (1,5 мл) містила 50 мМ КФБ (рН 7,0), 0,5 мМ ЕДТА, 0,25 мМ НАДФН, 1 мМ окисленого глютатіону та 100 мкл супернатанту. Реакцію починали додаванням супернатанту.

Обчислення активності проводили з використанням стандартної формули (рівняння 2.6) з внесенням відповідних для кожного ферменту значень коефіцієнтів молярної екстинції сполук, за якими проводилося спектрофотометричне реєстрування реакції.

, (2.6)

де А – активність ферменту, Од/мг білка;

ΔОD_хв – зміна оптичного поглинання за 1 хв;

V_пр – об’єм проби, мл;

ε – коефіцієнт молярної екстинції;

V_суп – об’єм супернатанту, мл;

[білок] – концентрація білка в супернатанті (мг/мл).

За одну одиницю активності каталази, ГПО, АПО, ГР та ГSТ приймали таку кількість ферменту, яка перетворює 1 мкмоль субстрату або утворює 1 мкмоль продукту за 1 хвилину за вказаних умов. Питому активність зазначених ферментів виражали в одиницях (Од) чи міліодиницях (мОд) та нормували на міліграм загального білка супернатанту (Од/мг білка або мОд/мг білка).

Визначення загальної концентрації білка. Концентрацію білка визначали за методом Бредфорд [Bradford, 1976], який ґрунтується на здатності білків зв’язуватися з барвником Кумасі яскраво-голубим G-250 та утворювати забарвлені сполуки. До 1 мл зразка, який містив не більше 20 мкг білка, додавали 1 мл 0,005% розчину барвника Кумасі яскраво-голубого G-250 в 3% HClO₄. Через 15 хв інкубації при кімнатній температурі визначали оптичне поглинання проб при довжині хвилі 595 нм на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина). Вміст білка в досліджуваних пробах визначали за допомогою калібрувального графіка. Як стандарт використовували бичачий сироватковий альбумін.