101

Міністерство освіти і науки, молоді та спорту України

державний вищий навчальний заклад

ПРИКАРПАТСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені Василя Стефаника

На правах рукопису

ВАСИЛИК ЮЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 581.198 + 577.152.1

ВПЛИВ ЗОВНІШНІХ ФАКТОРІВ НА МОРФОМЕТРИЧНІ ТА БІОХІМІЧНІ ПОКАЗНИКИ У ПРОРОСТКАХ КУКУРУДЗИ

ZEA MAIZE L.

03.00.04 – біохімія

дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Лущак Володимир Іванович

Івано-Франківськ – 2015

ЗМІСТ

Перелік умовних скорочень 4

Вступ 5

Розділ 1. Огляд літератури 10

1.1. Активовані форми кисню в біологічних системах 10

1.1.1. Шляхи утворення АФК 10

1.1.2. Механізми знешкодження АФК 12

1.2. Активовані форми азоту 15

1.2.1. Синтез оксиду азоту в рослинах 15

1.2.2. Роль оксиду азоту за дії стресових факторів 17

1.3. Окисна та нітрозитивна модифікація білків 19

1.4. Пероксидне окислення ліпідів 23

1.5. Відповідь рослин на стрес 25

1.5.1. Сольовий стрес 25

1.5.2. Вплив донорів азоту на рослинний організм 29

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень 33

2.1. Реактиви 33

2.2. Рослинний матеріал та умови проведення експерименту 33

2.3. Визначення ростових параметрів 34

2.4. Визначення концентрації пігментів 34

2.5. Визначення активності ферментів та концентрації загального білка 36

2.6. Визначення показників оксидативного стресу 38

2.7. Визначення вмісту тіолових сполук 40

2.8. Вивільнення оксиду азоту з нітропрусиду натрію 41

2.9. Загальний антиоксидантний потенціал 42

2.10. Статистична обробка даних 42

Розділ 3. Результати досліджень та їх обговорення 43

3.1. Вплив хлориду натрію на морфометричні та біохімічні параметри

проростків кукурудзи 43

3.1.1. Морфометричні показники проростків кукурудзи 43

3.1.2. Концентрація пігментів 48

3.1.3. Вміст карбонільних груп білків 51

3.1.4. Концентрація тіобарбітурат-активних продуктів 52

3.1.5. Вміст тіолових сполук 54

3.1.6. Активність антиоксидантних ферментів 57

3.2. Вплив нітропрусиду натрію на пігментний склад та антиоксидантний

потенціал у системі in vitro 61

3.2.1. Вивільнення оксиду азоту з нітропрусиду натрію 61

3.2.2. Концентрація пігментів у листках кукурудзи 63

3.2.3. Вміст карбонільних груп білків 67

3.2.4. Активність ферментів 68

3.2.5. Антиоксидантний потенціал 74

3.3. Сумісний вплив нітропрусиду натрію та хлориду натрію на

біохімічні параметри проростків кукурудзи 77

3.3.1. Концентрація тіобарбітурат-активних продуктів за дії різних

концентрації нітропрусиду натрію 77

3.3.2. Концентрація пігментів 79

3.3.3. Концентрація тіобарбітурат-активних продуктів 81

3.3.4. Вміст карбонільних груп білків 83

3.3.5. Активність ферментів, які знешкоджують АФК та ферменти

аскорбат-глютатіонового циклу 85

Аналіз і узагальнення результатів досліджень 93

Висновки 98

Список використаних джерел 100

Перелік умовних скорочень

АПО – аскорбатпероксидаза

АФА – активовані форми азоту

АФК – активовані форми кисню

ВТ – високомолекулярні тіоли

ГST – глютатіон-S-трансфераза

ГПО – гваяколпероксидаза

ГР – глютатіонредуктаза

ЕТЛ – електроно-транспортний ланцюг

ЗТ – загальні тіоли

ІОК – індолоцтова кислота

КБ – карбонільні групи білків

КБФ – калій-фосфатний буфер

МДА – малоновий диальдегід

НЖК – ненасичені жирні кислоти

НПН – нітропрусид натрію

НР – нітратредуктаза

НТ – низькомолекулярні тіоли

ПОЛ – пероксидне окислення ліпідів

ТБК – тіобарбітурова кислота

ТБКАП – ТБК-активні продукти

ТЕАП – тролокс еквівалентний антиоксидантний потенціал

ТХО – трихлороцтова кислота

ФЦК – фериціанід калію

ВСТУП

Актуальність теми. Засолення, яке виникає переважно на зрошуваних ґрунтах є актуальною проблемою сьогодення, оскільки знижує урожайність сільськогосподарських культур в багатьох регіонах світу, в тому числі на південному сході України.

Підвищення концентрації солей у середовищі згубно впливає на розвиток рослин, оскільки порушує іонну та осмотичну рівноваги у клітині, що в деяких випадках може спричинити загибель організму. Фізіологічна дія сольового стресу пов’язана зі зневодненням, яке зумовлене зниженням водного потенціалу рослини та ускладнює всмоктування коренями води і поживних речовин. Засоленість індукує іонний стрес, який проявляється у зміні співвідношення концентрацій Na⁺/К⁺, а підвищення вмісту позаклітинного натрію негативно впливає на надходження калію в клітину. Високі концентрації йонів Na⁺ у клітині зумовлюють порушення клітинного циклу, структури мембран, сповільнюють процес фотосинтезу і стимулюють утворення активованих форм кисню (АФК) [Davenport and Tester, 2000]. Поряд з осмотичним та йонним стресами, сольовий стрес може викликати розвиток вторинного оксидативного стресу. Останній відзначають як короткочасне або постійне підвищення стаціонарної концентрації АФК, що призводить до порушення клітинного метаболізму та його регуляції, а також до пошкодження клітинних компартментів [Lushchak, 2011]. У захисті рослин від дії стресових факторів ключову роль відіграють антиоксиданти, які у рослин представлені низькомолекулярними сполуками та антиоксидантними ферментами [Semchuk et al., 2008].

Останнім часом проблему солестійкості рослин намагаються радикально вирішити шляхом конструювання трансгенних форм або застосуванням агрозаходів, спрямованих на посилення солестійкості існуючих сортів сільськогосподарських культур. До агрозаходів належать обробка насіння або проростків сублетальними концентраціями NaCl [Cuartero et al., 2006], а також застосування фітогормонів та їх міметиків [Amzallag et al., 1993 ]. Серед останніх відомим є оксид азоту (NO) та його донори, такі як нітропрусид натрію, S-нітрозоглютатіон та S-нітрозо-N-ацетилпенісиламін [Ederli et al., 2009; Hogg, 2000; Stamler et al, 1992].

Оксид азоту є важливою сигнальною молекулою у рослин, оскільки регулює багато фізіологічних процесів [Lamattina et al., 2003; Lamotte et al., 2005]. Крім функції сигнальної молекули, зокрема, при високих концентраціях, оксид азоту також може бути цитотоксичним для рослини. Відомо, що NO задіяний у розвитку рослин, регуляції проростання насіння [Giba et al., 1998], поділі клітин [Beligni and Lamattina, 2001] та старінні [Leshem et al., 1998]. Підвищення концентрації NO спостерігалося у відповідь на різні стресові фактори, такі як зараження патогенами [Durner et al., 1999], надмірне світло [Giba et al., 1998], оксиданти [Beligni and Lamattina, 2000] та інші стреси. Тому, при екзогенному додаванні NO може проявляти антиоксидантні властивості та підвищувати стійкість рослин до дії різних стресових факторів [Beligni et al., 2002].

Зв’язок даної роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 2008 по 2011 рік на кафедрі біохімії та біотехнології Прикарпатського національного університету ім. В. Стефаника і є частиною наукової тематики кафедри “Вивчення механізмів пристосування організмів до несприятливих умов навколишнього середовища з метою розробки методів підвищення їх адаптаційного потенціалу”, державний реєстраційний номер – 0107U001367.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити, як підвищення концентрації хлориду натрію та наявність оксиду азоту у живильному середовищі впливає на розвиток проростків кукурудзи, концентрацію пігментів, маркерів окисного пошкодження білків та ліпідів, а також активність антиоксидантних ферментів у листках.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити ростові параметри проростків кукурудзи у присутності високих концентрацій хлориду натрію протягом трьох діб;

2. Визначити концентрацію пігментів у листках проростків кукурудзи, які вирощували в присутності різних концентрацій хлориду натрію 24, 48 та 72 год та/або були оброблені нітропрусидом натрію;

3. Визначити вміст карбонільних груп білків, тіобарбітурат-активних продуктів та тіолових сполук у листках проростків кукурудзи за дії високих концентрацій хлориду натрію та/або при обробці донором азоту;

4. Визначити активність каталази, гваякол- та аскорбатпероксидази, глютатіон-S-трансферази та глютатіонредуктази у листках проросків кукурудзи при обробці досліджуваними речовинами;

5. Визначити загальний антиоксидантний потенціал водних та спиртових екстрактів проростків кукурудзи за дії нітропрусиду натрію та фериціаніду калію.

Об’єкт дослідження − морфометричні параметри та біохімічні процеси за умов сольового стресу та під впливом нітропрусиду натрію у листках проростків кукурудзи Zea maize L.

Предмет дослідження − процеси росту та розвитку, вміст пігментів, маркерів окисної модифікації білків та ліпідів, активність антиоксидантних ферментів.

Методи дослідження охоплювали біохімічні підходи: визначення активностей ферментів (каталази, пероксидаз, редуктаз), вмісту фотосинтетичних пігментів (хлорофілів, каротиноїдів, антоціанів), показників оксидативного стресу (карбонільних груп білків, тіобарбітурат-активних продуктів), тощо, а також методи статистичної обробки результатів.

Наукова новизна отриманих результатів.

В даній роботі проведене комплексне порівняльне дослідження перебігу біохімічних процесів у листках проростків кукурудзи за дії різних концентрацій хлориду натрію та нітропрусиду натрію, а також їхньої комбінації протягом різного часу (24, 48 та 72 год). Показано, що нітропрусид натрію частково запобігає інтенсифікації вільнорадикальних процесів в умовах сольового стресу. Показано, що обробка коренів проростів кукурудзи нітропрусидом натрію та/або високими концентраціями хлориду натрію призводили до:

1. Зростання вмісту пігментів за дії обох ефекторів у листках проростків кукурудзи;

2. Підвищення активності антиоксидантних ферментів при обробці хлоридом натрію та попередження цих змін за дії нітропрусиду натрію у листках;

3. Підвищення окисної модифікації білків та ліпідів за дії NaCl та зниження даного показника при обробці донором оксиду азоту у листках;

4. Нітропрусид натрію за низьких концентрацій (0,1 мM) може підвищувати загальний антиоксидантний потенціал проростків кукурудзи за рахунок водорозчинних антиоксидантів.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати досліджень розширюють наші уявлення про механізм впливу нітропрусиду натрію (донору оксиду азоту) та хлориду натрію на рослинні організми. Одержані дані є підставою для розробки методів підвищення солестійкості рослин за допомогою донорів оксиду азоту з метою збільшення продуктивності сільськогосподарських культур на засолених ґрунтах, а також за умов посухи та техногенних забруднень. Адаптовані для кукурудзи методики впроваджені в навчальний процес при проведенні лабораторних занять та при виконанні курсових і дипломних робіт на кафедрі біохімії та біотехнології Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника.

Особистий внесок здобувача. Основна ідея та мета дослідження були сформульовані спільно з науковим керівником – доктором біологічних наук, професором Лущаком В. І. Дисертантом самостійно проведений аналіз наукової літератури, виконана експериментальна частина роботи і статистична обробка даних. Допомогу при виконанні експериментів здійснювали – к.б.н. Н. Мосійчук та О. Пасат. Планування роботи, аналіз та обговорення отриманого матеріалу, підготовка рукописів статей проводилося спільно з науковим керівником. Всі розділи дисертації написані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на V Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2010), Х Українському біохімічному з’їзді (Одеса, 2010), VІ Міжнародній наукової конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2011), V Міжнародній конференції молодих науковців «Біорізноманіття. Екологія. Адаптація. Еволюція» (Одеса, 2011), звітно-наукових конференціях та засіданнях кафедри біохімії та біотехнології Прикарпатського національного університету ім. В. Стефаника (Івано-Франківськ, 2008 - 2011).

Публікації. За матеріалами дисертації надруковано п’ять статей у фахових наукових виданнях та четверо тез доповідей наукових конференцій та з’їздів.