Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

На перший план діагностики виступають виявлення збудника та його ідентифікація. Пошук та виявлення специфічних змін в організмі під впливом вірусу мають значення більше для постановки діагнозу ретроспективно.

Вірусоскопічне дослідження має обмежене використання у зв'язку з тим, що розміри більшості вірусів знаходяться за межами роздільної здатності світлового мікроскопу та можуть бути досліджені за допомогою електронної мікроскопії.

Вірусологічний метод діагностики інфекційного захворювання вірусної етіології складається з трьох етапів:

1. накопичення вірусу;

2. індикація (виявлення) вірусу;

3. ідентифікація вірусу.

Загальним принциповим положенням під час виділення вірусу є їх культивування у живій клітині (культурі клітин, курячому ембріоні, організмі тварини).

Накопичення та індикація вірусів у культурі клітин

Досліджуваний матеріал, в якому припустимо знаходиться цікавлячий нас вірус, суспендують у невеликій кількості культурального середовища, фільтрують через міліпоровий фільтр з метою видалення бактерій і вносять в колбу-матрац, який містить моношарову культуру чутливих клітин. Через 48 – 72 години реєструють появу змін. Неозброєним оком видно повну чи часткову деградацію моношару і його злущування з поверхні колби-матрацу. Морфологічні зміни клітин виявляють за допомогою інвертованого мікроскопу.

Інфікування курячих ембріонів

Д осліджуваний матеріал вводять в алантоїсну чи амніотичну порожнини, хоріоналантоїсну оболонку або жовтковий мішок курячого ембріону. Перед інфікуванням шкаралупу яйця дезінфікують етанолом і йодом. На овоскопі визначають межі повітряного мішка, розтинають його та за допомогою шприцу 0,1 – 0,2 мл досліджуваного матеріалу вводять у яйце на 2 – 3 мм нижче межі повітряного мішка. Отвір у шкаралупі заліплюють.

Інфіковані курячі ембріони інкубації у термостаті при t = 37 С упродовж 48 – 72 годин. Після періоду інкубації роблять розтин курячого яйця. Шкаралупу знову обробляють спиртом і 2 % розчином йоду. Розтинають куряче яйце ножицями, знімають оболонку і вивчають хоріоналантоїсну оболонку в місці інфікування, відмічаючи геморрагії та інші ураження.

Виявлення вірусів в культурі клітин та їх ідентифікація

Існують первинно-трипсоннізовані, напівперещеплювані та перещеплювані культури клітин.

Первинно-трипсонізовані культури клітин отримують безпосередньо із тканини тварини чи людини шляхом руйнування трипсином міжклітинної речовини. Отримані таким чином клітини переносять в колбу-матрац з поживним середовищем, в якому вони зберігають життєздатність протягом кількох генерацій, завдяки чому їх можна кілька разів пасивувати (пересівати). Такі культури клітин високочутливі до певних вірусів і широко застосовуються у вірусологічній практиці.

Напівперещеплювані культури клітин (фібробласти ембріону людини) зберігають диплоїдний набір хромосом, типовий для соматичних клітин у процесі 40-50 пасажів та під час культивування вірусів не відбувається злоякісної трансформації диплоїдних клітин.

Перещеплювані культури клітин здатні витримувати необмежену кількість пасажів, оскільки отримані з трансформованих або пухлинних клітин.

За характером росту культури поділяють на моношарові та суспендовані. Добре прикріплюються до підложки і ростуть в моношарі епітеліальні клітини та фібробласти. Клітини крові формують, як правило, суспендовані лінії. Живильні середовища, що застосовують для культур клітин, можуть бути ростовими та підтримуючими. Ростові середовища містять, поряд з іншими компонентами, 5-15% сироватки крові тварин і сприяють розмноженню клітин, швидкому росту й формуванню моношарових культур. Для виживання клітин у вже сформованому моношарі застосовують підтримуючі середовища, які містять близько 2% сироватки крові тварин.

Також існує класифікація живильних середовищ за походженням на природні та синтетичні.

Індикація (вивлення) вірусів

Цитопатична дія (ЦПД) (індикація вірусів на культурі клітин) – це дегенеративні зміни в клітинах, які з'являються в результаті репродукції в них вірусів. Характер ЦПД залежить в основному від:

• виду вірусу;

• дози вірусу;

• властивостей клітин та умов їх культивування.

Розрізняють повну і часткову дегенерацію клітин моношару.

Під час повної дегенерації відбувається тотальний некроз клітин і злущування моношару. Такою дією володіють, наприклад, віруси поліомієліту та Коксакі.

Часткова дегенерація клітин має кілька різновидів:

1 / вогнищева деструкція – на тлі збереженого моношару з'являються вогнища дегенерації (викликається вірусами віспи, вісповакцини, грипу);

2/ гроноутворення – клітини округлюються, збільшуються, частково зливаються між собою з утворенням характерних гроноподібних скупчень (викликаються аденовірусами);

3/ симпластоутворення – під дією вірусів клітини зливаються між собою з утворенням гігантських багатоядерних клітин – симпластів (чи синцитіїв). Ця властивість є характерною ознакою вірусів кору, паротиту, герпесу, парагрипу, респіраторно-синцитіального вірусу;

4/ трансформація клітин – онкогенні віруси здатні трансформувати клітини моношарових культур з утворенням фокусів проліферації.

Внутрішньоклітинні включення (індикація вірусів на культурі клітин) утворюються

п ід час репродукції деяких вірусів у цитоплазмі і ядрі клітин (наприклад, віспи, сказу, грипу, герпесу). Динаміка їх формування, форма, розмір, субклітинна організація, наявність у них вірусспецифічних нуклеїнових кислот і білків мають важливе діагностичне значення. Включення можна виявити під час мікроскопії мікропрепаратів.

Утворення бляшок (метод негативних колоній). Цей метод дозволяє проводити кількісне визначення вірусів. Для виявлення вірусів використовують моношарові культури, які заражають матеріалом, що містить вірус та покривають шаром агару з індикатором.

К олбу-матрац інкубують при t = 37 ⁰С. Через 48-72 години виявляють плями-бляшки. Ці плями виникають за рахунок ЦПД вірусу.

Реакція гемаглютинації (РГА) (індикація вірусів на курячих ембріонах)

Після розтину курячого ембріону відсмоктують алантоїсну рідину і розливають її у комірки планшету по 0,5 мл (для контролю беруть 0,5 мл такої ж рідини незараженого ембріону). Потім додають по 0,2 мл 1 % суспензії відмитих курячих еритроцитів та інкубують при кімнатній температурі. Облік реакції роблять через 40 хвилин після осідання еритроцитів:

+ + + + – виражена гемаглютинація – тонка плівка склеєних еритроцитів на дні, яка має вигляд парасольки,

+ + + – наявність просвітів в плівці,

+ + – плівка зі склеєних еритроцитів має фестончасті краї,

+ – пластівцеподібне зсідання еритроцитів, яке оточене невеликою кількістю аглютинованих еритроцитів.

– – чітко окреслене зсідання еритроцитів, що не відрізняється від контролю.

Наявність гемаглютинації у дослідних комірках в разі її відсутності в контрольних комірках вказує на вміст вірусу в досліджуваній рідині.

У разі позитивної реакції гемаглютинації, тобто, якщо в алантоїсній рідині присутній вірус, відбувається утворення комплексу курячий еритроцит + вірус (гемаглютинація), який можна візуально побачити у комірці планшетки "у вигляді парасольки" за рахунок зсідання еритроцитів.

Якщо вірус, який здатний до гемаглютинації у алантоїсній рідині відсутній, то у комірці спостерігається зсідання еритроцитів з утворенням рівних країв – "у вигляді ґудзика".

Схема позитивної РГА

Реакція гемадсорбції (РГадс) (індикація вірусів на культурі клітин)

РГадс дозволяє виявити вірус до розвитку ЦПД завдяки появі на поверхні інфікованої клітини вірусспецифічного антигену. При цьому еритроцити адсорбуються на інфікованих клітинах моношару.

Еритроцити

Під час мікроскопії моношару культури клітин, на яку нанесли вірусвмісний матеріал від хворого у позитивному випадку спостерігається ефект гемадсорбції в наслідок здатності вірусінфікованих клітин адсорбувати на своїй поверхні курячі еритроцити (за рахунок наявності на поверхні клітин вірусних антигенів).

При негативному результаті (коли у матеріалі не було вірусу) еритроцити не адсорбуються на культурі клітин.

Ідентифікація вірусів

Ідентифікація вірусів здійснюється за допомогою специфічних противірусних антисироваток у РН, РГГадс, РГГА, РЗК та ін. Ці ж реакції можна застосувати під час серологічної діагностики захворювання, оскільки виявляються антитіла в сироватці крові хворого.