2. Материалы и методы

2.1 Растительный материал

В данном эксперименте в качестве растительного материала использовались семена Allium Fistulosum сорта «Русский зимний» и растительные экспланты, полученные в дальнейшем из побегов, образовавшихся при нестерильном проращивании семян.

2.2 Методы исследования

Методы проращивания: -нестерильный

-стерильный

При нестерильном проращивании в каждую чашку Петри на влажную фильтровальную бумагу было выложено по 10 семян. После чего чашки были размещены в световой комнате для дальнейшего наблюдения.

При стерильном проращивании семена были помещены в марлевые мешочки, обработаны 5% раствором NaOCl в течение 12 минут и помещены на питательные среды МС с содержанием фитогормонов и без, из расчета по 10 штук в одну чашку. Расстояние между семенами ~1 см. На каждой чашке указывалась дата, концентрация гормона и время стерилизации.

Для получения более точной оценки, семена и экспланты подвергались различному времени стерилизации, а также были помещены на среды с различной концентрацией 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4*D)- синтетического гормона-ауксина, способствующего образованию каллуса.

Были использованы следующие концентрации гормона:

-б/г

-1мг/л

-2мг/л

-3мг/л

-4мг/л

Образовавшиеся при нестерильном проращивании побеги были поделены на экспланты, простерилизованы в NaOCl (5%) 5 и 10 минут, а затем помещены на питательные среды с различной гормональной концентрацией.

Различные условия проращивания позволяют установить наиболее оптимальные условия для появления желаемых результатов, таких как, в данном случае, образование каллуса.

Также, различное время стерилизации позволяет найти оптимальный вариант, при котором будет минимум заростов, а семена и экспланты сохранят жизнеспособность.

При обнаружении плесневых заростов, весь растительный материал данной чашки Петри признавался непригодным для дальнейших исследований и подвергался утилизации.

При бактериалных заростах здоровый материал извлекался из зараженной чашки Петри и помещался в стерильную чашку с аналогичной питательной средой.

3. Результаты и обсуждение

В ходе эксперимента были получены нестерильные проростки, часть которых послужила растительным эксплантом- была разделена на кусочки ~0,5 см и помещена в чашки Петри на питательные среды различной гормональной концентрации, вторая часть (10 шт) была помещена в пробирки с безгормональной средой для дальнейшего роста.

Также, на стерильные питательные среды, с гормонами и без, были помещены семена для получения каллуса.

Чашки Петри №1-20 были по ошибке облучены ультрафиолетом, поэтому в дальнейшем не учитываются.

1. Нестерильное проращивание семян (на 8 день наблюдения)

№ Чашки	Доля проросших семян,%
1	70
2	90
3	80
4	80
5	80
Среднее ± доверит. интервал	{75,63 ; 84,37}

Таблица №1

На Графике №1 показана интенсивность прорастания семян в нестерильных условиях на влажной фильтровальной бумаге. В чашках №16 и №19 была обнаружена плесень, поэтому в дальнейшем экспеименте они не участвовали.

График №1

2. Стерильное проращивание (на 10 день).

Состав среды	№ чашки	Контаминация (+/-)
Б/г	1	_
	2	+
	3	+
	4	+
	5	_
1 мг/л	1	+
	2	+
	3	+
	4	+
	5	+

2 мг/л	1	+
	2	+
	3	+
	4	+
	5	+

3 мг/л	1	+
	2	+
	3	+
	4	+
	5	+

4 мг/л	1	+
	2	+
	3	+
	4	+
	5	+

Таблица №2

На 10 день эксперимента проростков не наблюдается, незараженные семена были пересажены на питательные среды с аналогичным содержанием гормона. Выжило лишь 28% семян.

Часть нестерильно полученных проростков поделена на экспланты и помещена на питательную среду МС с приведенными ранее концентрациями гормона, а вторая часть- на безгормональную среду для дальнейшего наблюдения.

Время стерилизации семян 12 минут.

Результат на 24 день эксперимента (семена)

Состав среды	№ чашки	Доля проросших семян,%	Частота каллусогенеза, %	Контаминация
1мг/л	1	20	10	+
	2	0	0	+
2мг/л	1	0	0	_
	2	0	0	+
3мг/л	1	0	0	+
4мг/л	1	10	0	+
	2	0	0	+
Среднее		4,29	1,43

Таблица №3

Результат на 48 день эксперимента (семена)

Состав среды	№ чашки	Доля проросших семян,%	Частота каллусогенеза, %	Контаминация
1 мг/л	1	20	20	+
	2	10	0	+
2 мг/л	1	0	0	_
	2	0	0	+
3 мг/л	1	0	0	+
4 мг/л	1	10	0	+
	2	10	0	+
Среднее		7,14	2,86

Таблица №4

График №2

Результаты на 12 день эксперимента (экспланты)

Состав среды	№ чашки	Время стерилизации	Доля живых проростков, %	Частота каллусогенеза, %	Контаминация
б/г	1	5 мин	100	0	+
	2	10 мин	100	0	+
1 мг/л	1	5 мин	90	0	+
	2	10 мин	70	0	+
	3	5 мин	100	0	+
2 мг/л	1	5 мин	100	0	+
	2	10 мин	100	0	+
3 мг/л	1	5 мин	100	0	+
	2	10 мин	90	0	+
4 мг/л	1	5 мин	90	0	+
	2	5 мин	90	0	+
	3	10 мин	80	0	+
Среднее			92,5	0

Таблица №5

Результаты на 36 день исследования (экспланты)

Состав среды	№ чашки	Время стерилизации, мин	Доля живых проростков, %	Частота каллусогенеза, %	Контаминация
б/г	1	5	20	0	+
	2	10	30	0	+
1мг/л	1	5	20	0	+
	2	10	0	0	+
	3	5	30	0	+
2 мг/л	1	5	10	0	+
	2	10	0	0	+
3 мг/л	1	5	0	0	+
	2	10	0	0	+
4 мг/л	1	5	0	0	+
	2	5	0	0	+
	3	10	0	0	+
Среднее			9,17	0

Таблица №6

Таким образом, можно отметить, что развитие растительных образцов на питательной среде в стерильных условиях крайне низкое, в отличие от нестерильного проращивания.

Далее рассмотрим результат помещения нестерильно полученных проростков на безгормональную питательную среду.

1)Первый день помещения на питательную безгормональную среду(18.06)

2)Результат на 36 день (24.07)

Наилучший результат Плесневый зарост

Далее представлены графики развития проростков в пробирках на б/г среде.

График №3

График №4

Пробирки №6 и №7 были поражены плесенью, а №2 и №9 засохли.