МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ –

МСХА имени К.А. ТИМИРЯЗЕВА

(ФГБОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева)

Факультет агрономии и биотехнологии

Кафедра генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства

Отчет

о прохождении производственной практики

по направлению 240700.62 «Биотехнология»

Тема: Введение в культуру in vitro растений Allium fistulosum,

получение каллуса и регенерантов

Заведующий кафедрой Соловьев А.А.

(_____________________________)

Научный руководитель Чередниченко М.Ю.

(_____________________________)

Студент Мамалыга П.Н.

(_____________________________)

Москва, 2015

Аннотация

Данный эксперимент проводится с целью выявления и изучения хромосомных перестроек, которые возникнут в регенерантах, полученных из каллуса, благодаря перетасовке генов. Возникновение подобных изменений в геноме, возможно, приведет к обнаружению новых свойств и качеств растения.

При проведении этой работы первоочередной задачей является получение каллуса из семян и растительных эксплантов на питательной среде с использованием фитогормонов или без. Следующей ступенью является возникновение меристематических зон из каллуса и формирование из них растений. И, наконец, микроскопический анализ полученных растительных образцов для выявления изменений в геноме.

Оглавление

1. Обзор литературы………………………………………………………………4

2. Материалы и методы………………………………………………………….10

2.1 Растительный материал……………………………………………......10

2.2 Методы исследования………………………………………………….10

3. Результаты и обсуждение…………………………………………………….12

4. Выводы………………………………………………………………………...20

5. Список литературы……………………………………………………………21

Введение

Развитие методов биотехнологии, в основе которых лежит выращивание изолированных органов, тканей и клеток на искусственных питательных средах с последующей регенерацией целых растений, определяет все большее внедрение их в практику сельского хозяйства. Они способны значительно ускорить селекционный процесс и значительно расширить границы воздействия человека на живую природу.

Геном лука батуна остается слабо изученными по целому ряду причин, в числе которых: большой размер, высокая частота дупликаций и повышенная гетерозиготность. Размер генома A. fistulosum на 28 % меньше генома лука репчатого (Narayan, 1988), что делает его более удобным объектом исследования. Семена лука батуна (Allium fistulosuml.) характеризуются достаточно высоким спонтанным уровнем хромосомной нестабильности.

Цель работы: получение регенерантов из каллусной ткани и изучение их свойств

Задачи: 1. Получение каллуса из семян и эксплантов

2. Получение регенерантов из каллуса

3. Исследование свойств регенерантов на предмет хромосомных перестроек.

В ходе работы мы проведем сравнительный анализ сред, исходя из их способности образовывать каллус. Подберем оптимальные условия для здорового роста и развития растительного материала.

1. Обзор литературы

Отдел: Цветковые

Класс: Однодольные

Порядок: Спаржецветные

Семейство: Амариллисовые

Подсемейство: Луковые

Род: Лук

Вид: Лук-батун

Сорт: Русский зимний

Allium является крупнейшим и важным представителем род семейства Alliaceae и включает в себя 450 видов, широко распространены в северном полушарии

Лук-батун (лук татарский, лук дудчатый, лук песчаный) (Allium fistulosum L.) - многолетнее травянистое растение семейства Луковые, возделываемое ради рано отрастающей зелени. В открытом грунте дает высококачественную продукцию с апреля по ноябрь. Хромосомный набор- (2n = 16).

Имеет три подвида — Японский, Китайский и Русский (отличается высокой зимостойкостью и большой витаминозностью). Может расти на одном месте несколько лет. Образует малозаметную цилиндрическую луковицу, переходящую в ложный стебель с полыми дудчатыми листьями.

Зонтик шаровидный, многоцветковый; цветоножки тонкие, в 2—3 раза длиннее околоцветника, околоцветник колокольчатый; листочки околоцветника желтоватые, продолговатые, острые. Нити тычинок в 2—3 раза длиннее околоцветника, цельные.

Слева направо:

Соцветие. Цветки (увеличено). Луковички. Семена

В первый год после посева растение образует дудчатые листья, которые осенью отмирают.

Со второго года, а затем ежегодно батун выбрасывает стрелки, на которых формируются шарообразные соцветия.

Корни у лука-батуна сильно ветвятся и распространяются в стороны на расстояние 60-70 см и на глубину 30-40 см. Корневая система, которая весной начинает расти еще под снегом, к осени частично отмирает. К осени образуются молодые корни и среди них такие, которые втягивают ложную луковицу в почву и предохраняют ее тем самым от вымерзания.

От репчатого лука батун отличается более вкусной зеленью, которая дольше сохраняется в стадии, пригодной для потребления в свежем виде. Лук-батун размножается не только семенами, но и вегетативно - делением куста. К концу первого года растение образует до 5 дочерних разветвлений, к концу второго года - до 10 - 15, а к осени третьего года оно образует 20 - 30 отдельных растений, не связанных одно с другим. Вместе они напоминают большой куст.

Лук-батун зимостойкое и морозостойкое растение, переносит зимы с понижением температуры до -45°С. Семена начинают прорастать при температуре 2 -3°С, листья начинают расти уже при 1°С.

На одном месте батун может расти много лет, но после четвертого года жизни кусты, разрастаясь, резко сбавляют урожайность, сильно срелкуются. Поэтому чаще культуру ведут 3-4 года, потом плантацию обновляют посевом семян.

«Русский зимний» – салатный, среднеспелый, витаминный сорт. Период от начала отрастания листьев до технической спелости 27-30 дней. Листья светло-зелёные, со средним восковым налётом, длиной до 33 см. Вкус слабоострый. Товарную луковицу не формирует. Ценность сорта: отличные вкусовые качества листьев, высокая урожайность, зимостойкость, длительный срок отдачи зелёного товарного лука.

Химический состав, пищевые и лечебные свойства. В зеленых листьях лука-батуна содержатся сахара, эфирное масло, витамины С, А, В,, В2, PP. Причем витамина С в них в два раза больше, чем в зеленом пере репчатого лука.

Лук-батун содержит соли магния, калия и железа, имеет острый вкус, высокие вкусовые и целебные достоинства. Последние в значительной степени обусловлены высоким содержанием в нем фитонцидов. По действию на организм батун близок к репчатому луку.

Зеленые листья и все растение используют в сыром виде для приготовления различных салатов, а также в переработанном для - соусов, маринадов, приправ к мясным, рыбным и овощным блюдам. Может использоваться вместо репчатого лука в первых блюдах и домашних консервах.

Из лука-батуна получают препараты, понижающие кровяное давление и повышающие эластичность кровеносных сосудов. В народной медицине используется как болеутоляющее и тонизирующее средство. Хороший источник витаминов в ранневесенний период.

A. fistulosum обладает генами устойчивости к луковой листовой гнили (Currah, Maude, 1984), розовой корневой гнили (Netzer et al, 1985) и антракнозу (Galvan et al, 1997), а также к луковой мухе (de Ponti, Inggamer, 1984). Кроме того, лук батун отличается высоким содержанием сухого вещества, более острым вкусом и морозостойкостью, более ранним и более коротким цветением, большей привлекательностью соцветий для насекомых-опылителей (Van der Meer, Van Bennekom, 1978).

Геномы этого и других видов луков до сих пор слабо изученными из-за целого ряда причин, в числе которых: большой размер генома, высокая частота дупликаций и повышенная гетерозиготность.

Семена лука батуна (Allium fistulosuml.) характеризуются достаточно высоким спонтанным уровнем хромосомной нестабильности. На втором году хранения семян частота аберрантных анафаз в меристеме проростков может составить 3,5% и даже 14%, что зависит от сорта,

места вегетации и года урожая семян. На третьем году хранения частота аберрантных анафаз в клетках корневой меристемы проростков может достигать 10%, 20% и 35% - в зависимости от загрязнения мест произрастания материнских растений.

Накапливающиеся при хранении семян изменения в геноме позволяют рассматривать возраст семян как своеобразный мутаген, материальной основой которого являются метаболические процессы в хранящихся семенах.

Выращивание Allium fistulosum in vitro даёт возможность получить генетически однородный материал и освобождённый от вирусов и бактерий на протяжении всего года независимо от факторов внешней среды.

Регенерации растений in vitro из клеток, тканей и органов культур является предпосылкой для применения биотехнологий в размножении растений, селекции и генетического усовершенствования растений. Это единственная технология для производства больших количеств элитного посадочного материала, направленная на увеличение производства и производительности. Микроразмножение выгодно по сравнению с традиционными методами, так как оно может быть использовано для получения большого количества новых растений, таких как те, которые были генетически модифицированы или разводятся с помощью традиционных методов селекции растений.

Микроразмножение также используется, чтобы обеспечить достаточное количество проростков для посадки из исходного растения, которое размножается вегетативно. Это также приводит к быстрому крупномасштабному распространению новых генотипов.

In vitro методы были использованы с Allium для: (1) клонального размножения; (2) производство незараженных клонов; (3) сохранение зародышевой плазмы; (4) получения новых сортов через сомаклональной вариации и молекулярной генетики; и (5) вторичные исследования метаболизма.

Данная опытно-селекционная работа основана на использовании систем регенерации в пробирке, которые включают фазу каллусообразования. Затем из каллуса должны быть сформированы меристемы, заново, из тотипотентных клеток для осуществления регенерации. Это особенно полезно при генерации сомаклональной вариации между клонами, и для изучения трансформации.

Регенерация растения лука из каллуса, однако, имеет определенные требования, хотя они отличаются в зависимости от используемой технологии и исследовательской группы. Филлипс и Luteyn (1983) показали, что образование каллуса и регенерация была улучшена с помощью "пиклорам" как синтетического ауксина. Шахин и Канеко (1986) получили улучшение регенерации из каллуса с использованием средств (BDSx BDS макроэлементы и микроэлементы MS) в сочетании с дополнением of900 мг / литр гидролизата казеина. В 1994 году Марани показал, что с помощью цитокинина тидиазурон значительно повышает скорость пролиферации побегов чеснока из меристемы нарастания.

Рассморим пример получения каллуса из лука Шалота:

Два сорта А. сера, а именно Huruta (DZSHT-91) и Minjar (DZSHT-164-1B) были получены в сельскохозяйственном исследовательском центре, Debre-Zeit, Эфиопия. Свежие и неповрежденные луковицы промывали в водопроводной воде с жидким мылом для очистки от почвы и некоторых загрязняющих веществ из луковицы, затем обрабатывали стерильной водой, содержащей две капли Твина 20 на 100 мл и 20% хлорной извести в течение 15-20 минут с продолжительным перемешиванием и, наконец, промывали 5-10 раз дистиллированной водой. Для того чтобы удалить фунгициды и другие остатки, эксплантаты промывали в водопроводной воде, а затем в дистиллированной, три раза. Тогда внешние сухие чешуи снимаются и отпаадют. Нижние половинки луковиц, содержащих базальный диск, тщательно промывали и погружали в 70% спирт в течение 1-2 мин, затем

промывали четыре раза дистиллированной водой, поверхность стерилизовали в 5,25% раствор гипохлорита натрия (NaOCl) в течение 15 мин и снова ополаскивали четыре раза в дистиллированной воде.

Эксплантаты, которые вырезали из луковиц инокулировали в среде МС, содержащий 3% сахарозы и 0,8% агара, рН доводили до 5,7. При индукции каллуса среду дополняли 1 мг/л 2, 4-Д, НАА, кН и БАТ. Все среды помещались в автоклав при температуре 121°С, и давлении 1.05kg/см2 в течение 15 мин. Культуры инкубировали при комнатной температуре 25 ± 2°С и при свете дневных люминесцентных ламп.

Каллусогенез

В настоящем исследовании, был протестирована индукция каллусного потенциала двух сортов шалот с различными гормонами и гормональными комбинациями. Каллус начал образовываться с 28 до 30 дней инкубации в Huruta и Minjar. Несмотря на длинный период индуцирования каллуса, Minjar образовал больше каллуса, а также имел более высокий средний вес, чем Huruta.

Из данного исследования было очевидно, что среды MS, которые содержат 2,4-D, показали высокий каллусогенез (74,44%), которому необходим минимум 28 дней для инициирования каллуса, а затем НАА + БАТ, 2, 4-D + Кп и БАП, тогда как НАА и Кп показали самый низкий каллусогенез. Наибольший сырой вес каллуса находится в средах, содержащих 2, 4-D.