7.13.Раствор рибоксина 2% валидационная оценка методики анализарибоксинаспектрофотометрическим методом

ВАРИАНТ 1. ПРИ ДЛИНЕ ВОЛНЫ 249 нм (максимум рибоксина)

ВАРИАНТ 2. При длине волны 260 нм.

Изучить УФ-спектр рибоксина

Точную навеску СО рибоксина (около 0,0500г) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в воде, доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1,0 мл; раствора А и доводят водой до метки (0,001%).

УФ-спектр 0,001% раствора рибоксина в воде очищенной в области

220 – 285 нм имеет максимум поглощения при длине волны 249±2 нм

ЛИНЕЙНОСТЬ

Построение градуировочного графика

Точную навеску СО рибоксина (около 0,05г) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в воде, доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).

В мерные колбы вместимостью 100 мл последовательно вносят 0,5 мл; 1,0 мл; 1,5 мл; 2,0 мл; 2,5 мл раствора А и доводят водой до метки (получают 0,0005%; 0,001%; 0,0015%; 0,002% и 0,0025% растворы).

Измеряют оптическую плотность каждого раствора на спектрофотометре при длине волны 249 (или 260) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – вода очищенная.

Строят градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации, рассчитывают уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции. Данные заносят в таблицу 52.

Таблица 52 – Зависимость оптической плотности от концентрации.

Объем раствора А, мл	0,5	1,0	1,5	2,0	2,5
Концентрация полученного раствора, %	0,0005	0,001	0,0015	0,002	0,0025
Оптическая плотность

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Приготовить три модельных раствора рибоксина.

Таблица 53 –Приготовление модельных растворов глюкозы.

Модельная смесь	1 (А1)	2 (А2)	3 (А3)
Навеска рибоксина, г	0,150	0,200	0,250
Воды очищенной, мл	до 10 мл	до 10 мл	до 10 мл

Раствор А₁. Точную навеску рибоксина (около 0,15 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, растворяют в воде и доводят водой до метки.

Раствор А₂. Точную навеску рибоксина (около 0,2 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, растворяют в воде и доводят водой до метки.

Раствор А₃. Точную навеску рибоксина (около 0,25 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, растворяют в воде и доводят водой до метки.

Раствор Б₁, В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,5 мл раствора А₁ и доводят до метки тем же растворителем.

Раствор Б₂. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,5 мл раствора А₂ и доводят до метки тем же растворителем.

Раствор Б₃. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,5 мл раствора А₃ и доводят до метки тем же растворителем.

Растворы В₁, В₂, В₃. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 1,0 мл раствора Б₁ и доводят водой до метки.

Растворы В₄, В₅, В₆. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 1,0 мл раствора Б₂ и доводят водой до метки.

Растворы В₇, В₈, В₉. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 1,0 мл раствора Б₃ и доводят водой до метки.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 249 (или 260) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО рибоксина.

Приготовление раствора СО рибоксина.

Точную навеску рибоксина (около 0,05г) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в воде, доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1,0 мл раствора А и доводят водой до метки (раствор Б).

1 мл раствора Б содержит 0,00001 г СО рибоксина.

Расчет содержания рибоксина в процентах (открываемость R) проводят по формуле:

где: А_х – оптическая плотность исследуемого раствора;

А_о – оптическая плотность раствора СО рибоксина;

а_х – масса навески исследуемого образца рибоксина, г (0,15; 0,20 или 0,25 г);

0,00001 – содержание рибоксина в г в 1 мл раствора СО.

Результаты заносят в таблицу №___ и рассчитывают стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Приготовить раствор модельной смеси рибоксина А₂.

Раствор А₂. Точную навеску рибоксина (около 0,2 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, растворяют в воде, доводят водой до метки и перемешивают.

Раствор Б₂. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,5 мл раствора А и доводят водой до метки.

Затем готовят параллельно по три раствора.

Растворы В₁, В₂, В₃. В три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 1,0 мл раствора Б и доводят водой до метки.

Растворы В₄, В₅, В₆. В другие три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 1,5 мл раствора Б и доводят водой до метки.

Растворы В₇, В₈, В₉. В следующие три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 2,0 мл раствора Б и доводят водой до метки.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 249 (или 260) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО рибоксина.

Приготовление раствора СО рибоксина (см. выше).

Расчет содержания рибоксина в г/мл проводят по формуле:

где: А_х – оптическая плотность исследуемого раствора;

А_о – оптическая плотность раствора СО рибоксина;

0,00001 – содержание рибоксина в г в 1 мл раствора СО

а-навеска, взятая для анализа,г

V_a – объем аликвоты раствора Б, взятый для разведения (1,0; 1,5; 2,0 мл).

Результаты заносят в таблицу №___ и рассчитывают стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

14. Рибофлавина 0,002

Раствора калия иодида 3% 10,0

ВАЛИДАЦИОННАЯ ОЦЕНКА МЕТОДИК АНАЛИЗА РИБОФЛАВИНА

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

ЛИНЕЙНОСТЬ

Для установления максимума светопоглощения раствора рибофлавина снимают спектр поглощения 0,001% раствора СО в воде очищенной. Приготовление раствора описано ниже при построении градуировочного графика. Установлено, что максимум находится при длине волны 445 нм, при этом оптическая плотность А_ст=0,486.

Построение градуировочного графика

Точную навеску рибофлавина (около 0,05г) помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане, доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).

В мерные колбы вместимостью 100 мл последовательно вносят 1,0 мл; 3,0 мл; 5,0 мл; 7,0 мл; 9,0 мл раствора А и доводят водой до метки (получают 0,0002%; 0 0006%; 0,0010%; 0,0014% и 0,0018% растворы).

Измеряют оптическую плотность каждого раствора на спектрофотометре при длине волны 445 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – вода очищенная.

Строят градуировочный график зависимости концентрации от оптической плотности , рассчитывают уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции.

Данные заносят в таблицу.

Таблица 54. Результаты измерения оптической плотности.

V 0,02% р-ра (мл)	1	3	5	7	9
Конц. р-ра в %	0,0002	0,0006	0,0010	0,0014	0,0018
Оптическая плотность А

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Приготовить три модельных раствора рибофлавина с борной кислотой.

Таблица 55. Приготовление модельных смесей рибофлавина с калия йодидом.

Модельная смесь	1	2	3
Навеска рибофлавина (г)	0,03	0,05	0,07
Навеска калия йодида (г)	4,5	7,5	10,5
Воды очищенной	до 250 мл	до 250 мл	до 250 мл

Раствор А₁.(модельная смесь 1) Точные навески рибофлавина (около 0,03 г) и калия иодида(около 4,5 г) помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане и доводят водой до метки.

Раствор А₂. (модельная смесь 2) Точные навески рибофлавина (около 0,05 г) и калия иодида(около 7,5 г) помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане и доводят водой до метки.

Раствор А₃. .(модельная смесь 3) Точные навески рибофлавина (около 0,07 г) и калия иодида(около 10,5 г) помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане и доводят водой до метки.

Растворы Б₁, Б₂, Б₃. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 5,0 мл А₁ и доводят водой до метки.

Растворы Б₄, Б₅, Б₆. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 5,0 мл А₂ и доводят водой до метки.

Растворы Б₇, Б₈, Б₉. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 5,0 мл А₃ и доводят водой до метки.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 445 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность СО 0,002% раствора рибофлавина.

Приготовление раствора СО рибофлавина.

Точную навеску рибофлавина (около 0,05г) помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане, доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 50 мл вносят 5,0 мл раствора А и доводят водой до метки (раствор Б).

1 мл раствора Б содержит 0,00002 г СО рибофлавина.

Расчет содержания рибофлавина в процентах (открываемость) проводят по формуле:

(1) ,

где: А_х – оптическая плотность исследуемого раствора;

А_о – оптическая плотность раствора СО рибофлавина;

а_х – масса навеска исследуемого образца рибофлавина;

0,00002 – содержание рибофлавина в г в 1 мл раствора СО.

ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Приготовить модельный раствор рибофлавина №2 (табл.2).

Готовят параллельно по три раствора.

Растворы А₁, А₂, А₃. В три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 3,0 мл раствора модельной смеси 2 и доводят водой до метки.

Растворы А₄, А₅, А₆. В другие три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 5,0 мл раствора модельной смеси 2 и доводят водой до метки.

Растворы А₇, А₈, А₉. В следующие три мерные колбы вместимостью100 мл помещают по 7,0 мл раствора модельной смеси 2 и доводят водой до метки.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 445 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО рибофлавина.Расчет содержания рибофлавина в г/мл проводят по формуле:

(2) ,

где: А_х – оптическая плотность исследуемого раствора;

А_о – оптическая плотность раствора СО рибофлавина;

0,00002 – содержание рибофлавина в г в 1 мл раствора СО.

V_a – объем аликвоты раствора модельной смеси 2, взятый для разведения, мл.

Результаты заносят в таблицу №___ и рассчитывают стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).