Валидационная оценка методики анализа кислоты глутаминовой спектрофотометрическим методом

ЛИНЕЙНОСТЬ

Для установления максимума светопоглощения раствора кислоты глутаминовой снимают спектр поглощения раствора СО в воде очищенной. Приготовление раствора описано ниже при построении градуировочного графика. Также измеряют спектр поглощения таблеток кислоты глутаминовой (методика приготовления раствора таблеток приведена в разделе «Прецизионность»). Максимумы поглощения должны совпадать при λ_max.

Построение градуировочного графика

Точную навеску кислоты глутаминовой (около 0,05 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл воды очищенной, нагревают на водяной бане до растворения. После охлаждения доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).

В мерные колбы вместимостью 50 мл последовательно вносят 0,5 мл; 1,0 мл; 1,5 мл; 2,0 мл; 2,5 мл раствора А, прибавляют 1 мл фосфатного буферного раствора с рН 6,8 и 3 мл 1% спиртового раствора нингидрина, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем охлаждают и доводят водой очищенной до метки.

Оптическую плотность каждого раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 490 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Раствор сравнения

В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл воды, 1 мл фосфатного буферного раствора с рН 6,8 и 3 мл 1% спиртового раствора нингидрина, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин., затем охлаждают и доводят водой очищенной до метки.

Данные заносят в таблицу.

Таблица 26. Результаты измерения оптической плотности.

V р-ра СО кислоты глютаминовой(мл)	0,5	1,0	1,5	2,0	2,5
Конц. р-ра, г/мл	0,000005	0,00001	0,000015	0,00002	0,000025
Оптическая плотность А

Строят градуировочный график, рассчитывают уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Приготовить три модельных смеси таблеток кислоты глутаминовой.

Таблица 27. Приготовление модельных смесей таблеток кислоты глутаминовой

Модельная смесь	1 (А1)	2 (А2)	3 (А3)
Навеска кислоты глутаминовой - субстанции (г)	0,200	0,250	0,300
Таблеточная масса – натрия хлорид (г)	0,200	0,150	0,100
Средняя масса	0,400	0,400	0,400

.

Модельная смесь А₁. Точные навески кислоты глутаминовой – субстанции (0,200 г) и таблеточной массы – натрия хлорида (0,200 г) смешивают в ступке до однородной массы.

Модельная смесь А₂. Точные навески кислоты глутаминовой – субстанции (0,250 г) и таблеточной массы – натрия хлорида (0,150 г) смешивают в ступке до однородной массы.

Модельная смесь А₃. Точные навески кислоты глутаминовой – субстанции (0,300 г) и таблеточной массы – натрия хлорида (0,100 г) смешивают в ступке до однородной массы.

Растворы Б₁, Б₂, Б₃. В три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 0,10 г модельной смеси А₁ (1) и далее проводят определение как указано в разделе «Линейность».

Растворы Б₄, Б₅, Б₆. В три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 0,10 г модельной смеси А₂ (2) и далее проводят определение как указано в разделе «Линейность».

Растворы Б₇, Б₈, Б₉. В три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 0,10 г модельной смеси А₃ (3) и далее проводят определение как указано в разделе «Линейность».

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 490 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Параллельно измеряют оптическую плотность СО 0,001% раствора кислоты глутаминовой.

Приготовление раствора СО кислоты глутаминовой:

Точную навеску кислоты глутаминовой (0,05 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане, доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 50 мл вносят 1,0 мл раствора А и далее проводят определение как указано в разделе «Линейность».

1 мл раствора содержит 0,00001 г/мл СО кислоты глутаминовой.

Расчет содержания кислоты глутаминовой в процентах (открываемость) проводят по формуле:

(1) ,

где: А_х – оптическая плотность исследуемого раствора;

А_о – оптическая плотность раствора СО кислоты глутаминовой;

а_х – масса навеска исследуемого образца таблеточной массы кислоты глутаминовой (0,2 г; 0,25 г; 0,3 г);

0,00001 – содержание кислоты глутаминовой в г в 1 мл раствора СО;

С₁, С₂, С₃ – содержание кислоты глутаминовой в модельных смесях.

Результаты заносят в таблицу №___ и рассчитывают стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Приготовить модельный раствор таблеточной массы кислоты глутаминовой № 2 (табл. 2).

Готовят параллельно по три раствора.

Растворы А₁, А₂, А₃. В три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают точную навеску (около 0,05 г) таблеточной массы кислоты глутаминовой модельной смеси 2 и далее проводят определение по методике, приведенной в разделе «Линейность».

Растворы А₄, А₅, А₆. В другие три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают точную навеску (около 0,1 г) таблеточной массы кислоты глутаминовой модельной смеси 2 и далее проводят определение по методике, приведенной в разделе «Линейность».

Растворы А₇, А₈, А₉. В следующие три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают точную навеску (около 0,15 г) таблеточной массы кислоты глутаминовой модельной смеси 2 и далее проводят определение по методике, приведенной в разделе «Линейность».

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 490 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО кислоты глутаминовой.

Расчет содержания кислоты глутаминовой в г/мл проводят по формуле:

(2) ,

где: А_х – оптическая плотность исследуемого раствора;

А_о – оптическая плотность раствора СО кислоты глутаминовой;

0,00001 – содержание кислоты глутаминовой в г в 1 мл раствора СО;

а_х – навеска таблеточной массы кислоты глутаминовой, г;

Р_ср – средняя масса таблеток кислоты глутаминовой, г.

Результаты заносят в таблицу №___ и рассчитывают стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

6. Таблетки левомицетина 0,25

ВАЛИДАЦИОННАЯ ОЦЕНКА МЕТОДИКи спектрофотометрического АНАЛИЗА

левомицетина в максимуме светопоглощения

при длине волны 278 нм

ЛИНЕЙНОСТЬ

Для установления максимума светопоглощения раствора левомицетина снимают спектр поглощения 0,002% раствора СО в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной. Приготовление раствора описано ниже при построении градуировочного графика. Максимум должен находиться при длине волны 278 ±2 нм.

Построение градуировочного графика

Точную навеску СО левомицетина (около 0,1 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 15 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, перемешивают, доводят тем же растворителем до метки, перемешивают (раствор А).

В мерные колбы вместимостью 100 мл последовательно вносят 1,0 мл; 2,0 мл; 3,0 мл; 4,0 мл; 5,0 мл раствора А и доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки (получают 0,001%; 0,002%; 0,003%; 0,004% и 0,005% растворы).

Измеряют оптическую плотность каждого раствора на спектрофотометре при длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной.

Данные заносят в таблицу.

Таблица 28. Результаты измерения оптической плотности.

V 0,1% р-ра (мл)	1	2	3	4	5
Конц. р-ра в %	0,001	0,002	0,003	0,004	0,005
Оптическая плотность А

Строят градуировочный график, рассчитывают уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Приготовить три вида модельных смесей таблеток левомицетина по прописям, приведенным в таблице 29.

Таблица 29. Приготовление модельных смесей таблеток левомицетина.

Модельная смесь	1 (А1)	2 (А2)	3 (А3)
Навеска левомицетина - субстанции (г)	0,200	0,250	0,300
Таблеточная масса – натрия хлорид (г)	0,200	0,150	0,100
Средняя масса	0,400	0,400	0,400

Раствор модельной смеси А₁. Точные навески левомицетина – субстанции (около 0,200 г) и таблеточной массы – натрия хлорида (около 0,200 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 15 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, перемешивают, доводят тем же растворителем до метки, перемешивают.

Раствор модельной смеси А₂. Точные навески левомицетина – субстанции (около 0,250 г) и таблеточной массы – натрия хлорида (около 0,150 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 15 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, перемешивают, доводят тем же растворителем до метки, перемешивают.

Модельной смеси А₃. Точные навески левомицетина – субстанции (около 0,300 г) и таблеточной массы – натрия хлорида (около 0,100 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 15 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, перемешивают, доводят тем же растворителем до метки, перемешивают.

Растворы Б₁, Б₂, Б₃. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 1,0 мл раствора модельной смеси А₁ и доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки.

Растворы Б₄, Б₅, Б₆. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 1,0 мл раствора модельной смеси А₂ и доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки.

Растворы Б₇, Б₈, Б₉. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 1,0 мл раствора модельной смеси А₃ и доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной.

Параллельно измеряют оптическую плотность СО 0,002% раствора левомицетина.

Приготовление 0,002 %раствора СО левомицетина.

Точную навеску СО левомицетина (около 0,1г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной, доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки и перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 2,0 мл раствора А и доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки.

1 мл раствора Б содержит 0,00002 г СО левомицетина.

Расчет содержания левомицетина в процентах (открываемость) проводят по формуле:

,

где: А_х – оптическая плотность исследуемого раствора;

А_о – оптическая плотность раствора СО левомицетина;

а_х – масса навеска исследуемого образца левомицетина;

0,00002 – содержание левомицетина в г в 1 мл раствора СО.

Результаты заносят в таблицу №___ и рассчитывают стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Приготовить раствор модельной смеси А₂ таблеток левомицетина.

Готовят параллельно по три раствора.

Растворы Б₁, Б₂, Б₃. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 0,5 мл раствора модельной смеси А₂ и доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки.

Растворы Б₄, Б₅, Б₆. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 1,0 мл раствора модельной смеси А₂ и доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки.

Растворы Б₇, Б₈, Б₉. В три мерные колбы вместимостью 100 мл переносят по 1,5 мл раствора модельной смеси А₂ и доводят 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной.

Параллельно измеряют оптическую плотность СО 0,002% раствора левомицетина.

Расчет содержания левомицетина в г/мл проводят по формуле:

,

где: А_х – оптическая плотность исследуемого раствора;

А_о – оптическая плотность раствора СО левомицетина;

0,00002 – содержание левомицетина в г в 1 мл раствора СО.

V_a – объем аликвоты раствора модельной смеси 2, взятый для разведения, мл.

Результаты заносят в таблицу №___ и рассчитывают стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).