3.4.Результаты определения концентрации железа (III) в полиэлектролитных микрокапсулах и магнитоуправляемых липосомах методом эпр-спектроскопии

Химические методы определения концентрации железа (III) обладают достаточной точностью и специфичностью в синтетических (искусственных) объектах. При биомедицинском применении полиэлектролитных микрокапсул и липосом возникает задача, по изучению их биокинетики и тканевого распределения. Химические методы в данном случае не пригодны для определения концентрации железа (III), так как они не позволяют идентифицировать железо введенное в организм в капсулах, липосомах и собственное железо присутствующее в организме. Для этой цели необходим метод с помощью которого можно идентифицировать железо (III), входящее в состав магнитных наночастиц и ионизированное железо (III) организма (входящее в состав гемоглобина и миоглобина). В качестве такого метода был выбран метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

Специфичность основана на возможности достоверно определять магнетит в образцах и достигается путем использования проб сравнения. В качестве образца сравнения были взяты образцы донорской крови, в которых была определена концентрация железа методом фотоколориметрии.

Проводили анализ образцов крови (холостая проба) и образцов крови с добавлением магнитоуправляемых липосом и полиэлектролитных микрокапсул (опытный образец). При ЭПР-спектроскопии холостых образцов крови сигналов характерных для магнетита обнаружено не было. Данные представлены на рисунке 3.4.1.

Рис. 3.4.1.ЭПР-спектр поглощения холостой пробы и пробы с добавлением полиэлектролитных микрокапсул. Спектр поглощения для холостой пробы не был зарегистрирован

Для нахождения нижнего предела количественного определения магнетита проводили анализ проб, приготовленных из растворов коллоидного магнетита с концентрациями в диапазоне от 4,6 до 277,8 мг/л (4,6; 46,3; 185,2; 277,8 мг/л). Каждая проба содержала после высушивания то же количество магнетита, что и 10 мкл раствора, использовавшегося при ее приготовлении (0,05; 0,46; 1,85; 2,78 мкг). Выбор концентраций обусловлен литературными данными и результатами предварительных собственных исследований отношения сигнал/шум. Эксперименты по ЭПР-спектрометрии для каждого из проб проводили не менее 6 раз и определяли отношение сигнал/шум. Уровень шума определялся по ЭПР-сигналу контрольного образца, приготовленного из воды Milli-Q. Результаты исследований приведены в таблице 7.

Таблица 7 Нижний предел количественного определения магнетита методом ЭПР-спектроскопии

№ серии	Масса вещества в образце, мкг	№ анализа	Отношение сигнал/шум	Среднее	Погрешность	Относительная погрешность, %
1	0,05	1	2,0	1,7	0,2	14,4
		2	1,6
		3	1,7
		4	1,9
		5	1,3
		6	1,7
2	0,46	1	4,8	4,9	0,3	8,2
		2	4,7
		3	4,8
		4	5,1
		5	4,6
		6	5,4
3	1,85	1	7,3	6,9	0,3	4,9
		2	6,3
		3	6,8
		4	7,0
		5	6,9
		6	7,1
4	2,78	1	9,9	9,7	0,3	3,1
		2	9,7
		3	9,8
		4	9,6
		5	9,1
		6	10,1

За нижний предел количественного обнаружения принимали количество магнетита, для которой отношение сигнал/шум было более 5,0. Нижний предел количественного определения используемой методики составил 1,85 мкг/образец. Эта величина составляет 10 % от ожидаемой максимальной концентрации (2 мг/мл), что не превышает допустимый предел, от С_mах.

Для проверки линейности зависимости массы магнетита от концентрации ЭПР-центров была построена калибровочная кривая. Концентрацию железа в образцах измеряли методом фотоколориметрии далее рассчитывали концентрацию магнетита в образцах по формуле полученной из стехиометрии С_{магнетита}=С_Fe³⁺*1,38, учитывая что ЭПР-центры представлены только магнетитом. Для построения калибровочной кривой: были зарегистрированы 3 серии спектров поглощения ЭПР-центров образцов с известными концентрациями магнетита. Данные представлена в таблице 8.

Таблица 8 Калибровка для метода ЭПР-спектроскопии

Масса магнетита, мкг	Концентрация ЭПР-центров, ×103 (1/г)	Средняя концентрация ЭПР-центров, ×103 (1/г)	Погрешность	Относительная погрешность, %
1,852	3,10	2,90	0,4	13,7
	3,16
	2,44
2,778	4,06	4,06	0,4	11,3
	3,60
	4,52
3,704	4,27	4,96	0,7	14,3
	5,69
	4,92
4,630	7,22	7,81	0,7	9,4
	7,57
	8,64
9,260	12,7	12,7	1,5	11,8
	14,2
	11,2
18,520	28,9	28,9	4,1	14,2
	33,0
	24,8
46,300	79,8	74,8	7,0	9,35
	77,8
	66,8

По результатом средних значений концентраций ЭПР-центров была построена калибровочная кривая зависимости ЭПР-центров от массы магнетита рисунок 3.4.2.

Рис. 3.4.2. Калибровочная кривая для концентрации магнетита полученная методом ЭПР

Таким образом, проведенные исследования показали что концентрация магнетита в полиэлектролитных микрокапсулах и магнитоуправляемых липосомах выявляет корреляцию с концентрацией железа (III), определенной методом фотоколориметрии, R²=0,9989 Следовательно можно использовать концентрацию железа определенную фотоколориметрическим методом для калибровки ЭПР-спектрометра для измерений концентрации магнетита.

Для определения концентрации железа в образцах полиэлектролитных микрокапсул и магнитоуправляемых липосом, методом ЭПР использовали образцы в объеме 10мкл. Объем исследуемых образцов был в 10 раз меньше, чем объем образцов, исследованных химическими методами определения концентраций. Эксперименты проводились не менее 3 раз. Результаты определения концентраций, определенных методом ЭПР-спектроскопии, показаны в таблице 9.

Таблица 9 Значения концентраций ЭПР-центров

№ Образца	Конц.ЭПР-центров, ×103 (1/г)	Средняя конц. ЭПР-центров, ×103 (1/г)	mх, мкг	C(Fе3+),мг/л	Погрешность	Относительная погрешность, %
Мк1	12,24	12,21	8,08	586	0,09	0,71
	12,10
	12,26
МК2	17,56	17,54	10,91	792	0,12	0,07
	17,42
	17,66
Мк3	24,02	23,93	14,92	1084	0,93	4,44
	23,81
	21,96
Л1	31,90	31,85	20,83	1512	0,28	0,87
	32,11
	31,56
Л2	24,81	24,90	15,07	1092	0,11	0,43
	24,89
	25,02
Л3	3,49	3,55	2,75	195	0,08	2,04
	3,63
	3,53

В таблице представлены данные концентраций микрокапсул и магнитоуправляемых липосом полученных методом ЭПР-спектроскопии. Данные представленные в таблице 9, совпадают с данными полученными химическими методами, но обладают меньшей относительной погрешностью определения концентрации 0,07-4,5%.