3. Некоторые специальные приёмы оптической микроскопии.

а) Измерение размеров микроскопических объектов.

Определение величины микроскопических объектов выполняется с помощью окулярного М_ОК (рис.5а) и объектного М_ОБ (рис.5б) микрометров, представляющих из себя стеклянные пластины с нанесёнными на них масштабными шкалами. Окулярный микрометр устанавливается в плоскости промежуточного изображения, полученного от объектива. В окуляр наблюдается изображение шкалы, совмещённое с изображением микроскопируемого объекта.

Если известна цена деления шкалы окулярного микрометра, можно определить размер этого изображения, даваемого объективом, а разделив полученную величину на известное увеличение объектива – действительные размеры объекта.

Если цена деления окулярного микрометра неизвестна, то её можно определить с помощью объектного микрометра М_ОБ с известной ценой деления (обычно – 0,01 мм). Объектный микрометр помещают на место предмета. В окуляр наблюдают совмещённые изображения обоих шкал и определяют цену деления окулярного микрометра.

б ) Микропроекция и микрофотография.

В оптическом микроскопе получается мнимое изображение благодаря тому, что промежуточное действительное изображение, образуемое объективом, располагается между передним фокусом F_ОК и окуляром. Если придвинуть окуляр так, чтобы изображение, которое даёт объектив, оказалось бы перед передним фокусом окуляра (рис.6), то последний будет давать действительное изображение, которое может быть спроектировано на экран или фотопластинку. Окуляр в этом случае служит проекционной линзой. Можно удалить окуляр и проектировать на экран или фотопластинку действительное изображение, даваемое только объективом, хотя при этом увеличение будут меньшим.

Наблюдение на экране действительного изображения предметов, полученного одним из указанных способов, называется микропроекцией. Фотографирование полученного таким способом действительного изображения называется микрофотографией. Обычно для этого используется специальная фотонасадка к микроскопу, которая представляет собой фотокамеру, надеваемую на окулярный конец тубуса микроскопа. Изображение предмета проектируется на плоскость расположения фотопластинки. Фотонасадка снабжена визуальной трубкой для наблюдения за изображением в процессе съёмки.

Линейное увеличение микрофотонасадки к микроскопу определяется по формуле: , где х – расстояние в мм от окуляра микроскопа до фотопластинки; 250 – расстояние наилучшего зрения в мм. n_ОБ и n_ОК – увеличение объектива и окуляра.

в) Фазово-контрастный метод.

П ри прохождении световой волны через прозрачный объект интенсивность света почти не изменяется, но фазы претерпевают изменения, которые зависят от толщины объекта и его показателя преломления. Увидеть детали таких объектов обычным способом практически невозможно. Фазаво-контрастный метод применяется для наблюдения малоконтрастных объектов и основан на использовании разности фаз, которая образуется при прохождении света через различные структуры (участки) исследуемого объекта.

Допустим, что в однородной прозрачной среде объекта с показателем преломления n имеется прозрачное включение М с показателем преломления n₁, вызывающее дифракцию световых лучей (рис.7). При освещении объекта параллельным пучком лучей, часть его пройдёт через среду, сойдётся в небольшом участке фокальной плоскости F объектива, а затем попадут на экран распадающимся пучком. Лучи же, образовавшиеся вследствие дифракции света на неоднородности объекта, падают на объектив в виде расходящегося пучка и после объектива не пройдут через его фокус, а сойдутся на экране в некоторой точке , являющейся изображением включения М. Между лучами, падающими на препарат параллельно, и лучами, дифрагируемыми на неоднородности М, будет некоторая разность хода, которая увеличивается с помощью оптического устройства, называемого фазовой пластинкой, до половины длины волны ( ). Вследствие этого в точке прямые и дифрагирующие лучи интерферируют и взаимно гасят друг друга. Поэтому изображение включения М наблюдается затемнённым на светлом фоне окружающей его среды. Фазовая пластинка Ф представляет собой слой прозрачного вещества определённой толщины с определённым показателем преломления. Пластинка имеет форму кружка очень малого диаметра и устанавливается в фокусе объектива. Через неё проходят только лучи, которые падали на препарат параллельным пучком. Они получают при этом дополнительную разность хода по отношению к лучам, дифрагируемым на неоднородности М. Для фазово-контрастной микроскопии применяют особые объективы, содержащие фазовую пластинку и специальные конденсоры, которые устанавливаются в обычном биологическом микроскопе.