Preparaty_-_proizvodnye_tsiklopentanpergidrofenantrena__1

группой. Эстрогенные препараты проявляют с помощью реактивов на фенольный гидроксил – с солями диазония в щелочной среде, реактивом Гиббса и др.

Выбор системы растворителей зависит от структурных особенностей молекулы стероидных гормонов, наличия функциональных групп, влияющих на хроматографическое поведение стероидных соединений. Чаще всего для идентификации различных классов стероидных гормонов в фармакопейных и нефармакопейных методиках используются следующие системы растворителей:

–производные андростана и гестагены:

хлороформ – ацетон (9 : 1); бензол – ацетон (9 : 1); гексан – ацетон (7 : 3); бензол – этилацетат (8 : 2);

циклогексан – этилацетат (1 : 1);

–кортикостероиды:

хлороформ – метиловый спирт – вода (95 : 5 : 0,2); хлористый метилен – метиловый спирт – вода (95 : 5 : 0,4);

хлористый метилен – эфир – метиловый спирт – вода (77 : 15:8: 0,4); дихлорметан – эфир – метиловый спирт – вода (77 : 15:8: 1,2); хлороформ – ацетон (3:2); н-бутанол – толуол – эфир (5 : 10 :85);

– эстрогены:

гептан – ацетон (8 : 2); гексан – ацетон (7 : 3);

циклогексан – этилацетат – ацетон (75 : 25 : 10); бензол – этилацетат (8 : 2); бензол – эфир – ацетон (50 : 50 : 1); толуол – этиловый спирт (8 : 2).

Подлинность определяется путем сравнения хроматографической подвижности анализируемого и стандартного образца стероидных гормонов. Основное пятно исследуемого стероидного соединения по положению

ицвету должно полностью совпадать с пятном стандартного образца.

Вслучае определения наличия специфических примесей (посторонние стероиды), которые представлены исходными продуктами и полупродуктами синтеза, продуктами гидролитического расщепления и т.д., на пластинку наносится определенное количество стандартного образца препарата, в котором содержатся допустимые количества примесей или рабочего стандартного образца данной примеси. Это позволяет проводить количест-

31

венную оценку содержания примесей с помощью визуального или денситометрического определения, а также методом спектрофотометрии после элюирования вещества из слоя сорбента. Условия определения посторонних стероидов в некоторых препаратах стероидных гормонов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Определение посторонних стероидов в субстанциях и лекарственных формах стероидных гормонов методом ТСХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). ВЭЖХ является одним из ценных аналитических методов разделения и количественного определения стероидных гормонов. Метод включен в 9 статей на субстанции стероидных гормонов ЕФ (ципротерона ацетат, дезоксикортона ацетат, дексаметазон, эстрадиол, гидрокортизон, преднизон и др.). Основными преимуществами ВЭЖХ в анализе доброкачественности субстанций и лекарственных форм стероидных гормонов являются:

–универсальность, что позволяет подобрать хроматографические системы для разделения всех классов стероидных гормонов;

–простота в приготовлении анализируемых образцов;

–возможность разделения изомеров, например, определение примеси α-эстрадиола в эстрадиоле и бетаметазона в дексаметазоне.

Рассмотрим основные экспериментальные параметры, включенные в НД для анализа субстанций и лекарственных форм стероидных гормонов методом ВЭЖХ.

Тип сорбента и размеры хроматографической колонки. Для опре-

деления профиля примесей стероидных гормонов используются адсорбционные (нормально-фазный режим) и распределительные (обращено-фазный режим) хроматографические системы. В качестве адсорбентов нормальнофазного режима разделения чаще всего используется силикагель с малым размером частиц (5–10 нм), а обращено-фазного – силикагель с привитыми

молекулами октадецилсилана (Кизельгель C18, Бондапак C18, Сепарон C18 и

др.).

Для хроматографического разделения в режиме высокого давления используются стальные колонки длиной 10–25 см с внутренним диаметром

0,3–0,5 см.

Состав элюента и характер элюирования. Для элюирования стеро-

идных гормонов в обращено-фазном режиме ВЭЖХ используются полярные элюенты. Как правило, это 30–40% водные растворы ацетонитрила, а также их смеси с уксусной кислотой или метанолом.

Вадсорбционном варианте ВЭЖХ в качестве элюентов используют смеси: метанол – хлороформ (5 : 70), хлористый бутил – насыщенный водный раствор хлористого бутила – тетрагидрофуран – метанол – безводная уксусная кислота (475 : 475 : 70 : 35 : 30) и др.

Чаще всего используется изократический режим элюирования.

Тип детектора. Для детектирования стероидных гормонов универ-

сальным является УФ-детектор с переменной или фиксированной длиной волны. Детектирование 4- и 1,4-3-кетостероидов (андрогены, анаболики,

34

гестагены и кортикостероиды) проводят при длине волны 254 нм, для эстрогенов выбирают, как правило, специфическую длину волны – 280 нм.

Чувствительность ВЭЖХ существенно увеличивается при использовании электрохимического детектора (предел обнаружения 1 нг). Если эстрогены хроматографировать в виде флюоресцирующих дансилпроизводных, то предел обнаружения составляет ниже 0,05 нг.

5.1.2. Химические методы

Стероидные гормоны содержат в своей структуре ограниченный набор функциональных групп и функциональных фрагментов, пригодных для проведения функционального анализа.

Наличие стероидного цикла в структуре препаратов подтверждается концентрированной серной кислотой, которая является общим внутригрупповым специфическим реактивом. По окраске продуктов реакции, наличию или отсутствию флюоресценции в УФ-области спектра, изменению окраски после добавления воды (МФ III, ЕФ-1997, НД) или хлороформа (ГФ) можно отличить даже близкие по структуре лекарственные средства группы стероидных гормонов.

Методики проведения данной реакции отличаются, так, МФ и ЕФ рекомендует навеску препарата (1–2 мг) растворить в 2 мл концентрированной серной кислоты и через 5 мин должна появиться характерная окраска и

внекоторых случаях флюоресценция в УФ-свете. После чего необходимо добавить 10 мл воды, встряхнуть и зафиксировать изменение окраски и флюоресценции (см. табл. 3).

При испытании подлинности этистерона (прегнина) и норэтистерона методика проведения реакции модифицируется: 2 мг препарата растворяют

в2 мл безводного этанола и добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты, смесь нагревают на водяной бане при температуре 70 °С; наблюдают сине-фиолетовое окрашивание с красной флюоресценцией (этистерон) или голубовато-фиолетовое окрашивание с красной флюоресценцией (норэтистерон).

ВГФ на препараты стероидных гормонов реакция с концентрированной серной кислотой используется в трех вариантах: 1) без добавления воды, 2) с добавлением воды и 3) с добавлением воды и хлороформа (см. табл. 4 и 5).

Значительные различия в окраске продуктов реакции с концентрированной серной кислотой для препаратов стероидных гормонов, согласно требованиям ГФ и ЕФ, можно объяснить более высокими требованиями, предъявляемыми ЕФ, к чистоте препаратов (посторонние стероиды).

35

Таблица 5

Окраска продуктов реакции препаратов стероидных гормонов с концентрированной серной кислотой в хлороформе по ГФ XI

Характерной реакцией идентификации 3-кетогруппы андрогенов, гестагенов и кортикостероидов служит реакция присоединения – элиминирования при взаимодействии с аминами в кислой среде с последующим измерением температуры плавления выделившегося осадка или образованием окрашенного продукта реакции. В качестве реактивов ГФ рекомендует использовать:

–гидроксиламина гидрохлорид (образуются осадки белого цвета)

–оксим этистерона – tпл = 226–232 °С

–оксим тестостерона пропионата – tпл = 166–171 °С

–оксим метилтестостерона – tпл = 210–216 °С;

–2,4-динитофенилгидразин (образуются осадки оранжево-красного

цвета)

–3,20-бис-2,4-динитрофенилгидразон прогестерона – tпл =

= 270–275 °С;

–2,4-динитрофенилгидразон метандиенона;

–фенилгидразин (образуются осадки желтого цвета)

–фенилгидразон преднизолона

–фенилгидразон преднизона.

Фенольное кольцо А эстрогенов обнаруживают по реакции этерификации с бензоилхлоридом, например, этинилэстрадиола бензоат имеет температуру плавления 199–202 °С.

Из цветных реакций на фенольный гидроксил чаще всего используется реакция азосочетания с солями диазония, полученными на основе сульфаниловой кислоты, 3-нитроанилина, сульфатиазола и др.

37

Полученный азокраситель в щелочной среде имеет вишнево-красную окраску, а в нейтральной или слабокислой среде этот продукт представляет собой оранжево-красный осадок.

Для идентификации эстрадиола или эстрадиола бензоата (ЕФ) по 1 мг препаратов смешивают с 0,5 мл свежеприготовленного раствора молибдата аммония в концентрированной серной кислоте (реактив Фреде), появляется голубое окрашивание с интенсивной зеленой флюоресценцией в УФ-свете или желтовато-зеленое окрашивание с интенсивной зеленой флюоресценцией соответственно. После добавления 1 мл концентрированной серной кислоты и 9 мл воды окраска растворов изменяется в розовую с желтоватой флюоресценцией.

Этинильный фрагмент в структуре этинилэстрадиола, прегнина и норэтистерона обнаруживается по реакции солеобразования с ионами серебра за счет подвижного атома водорода:

При использовании в качестве реактива аммиачного раствора нитрата серебра (ЕФ) и нагревании на водяной бане выпадает белый осадок ацетиленида серебра, который при дальнейшем нагревании переходит в серый, а затем на стенках пробирки образуется «серебряное зеркало».

38

α-Кетольная группа (20-кето-21-гидроксигруппа) кортикостероидов проявляет восстановительные свойства и идентифицируется с помощью реактивов Фелинга, Несслера и Толленса, реакция протекает по схеме:

Реакция с 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом и тетразолиевым синим в щелочной среде также основана на восстановительных свойствах α-кетольной группы. ФС и ЕФ рекомендуют использовать ее для идентификации и количественного фотоколориметрического определения флюоцинолона ацетонида и триамцинолона в субстанции и лекарственных формах:

39

Глюкокортикоиды можно определить также реакцией с фенилгидразином в присутствии серной кислоты по появлению желтой окраски раствора.

Ковалентносвязанный фтор фторкортикостероидов (дексаметазон, бетаметазон, триамцинолон и др.) открывают по реакции с ализаринатом циркония после минерализации молекулы со спекающей смесью (KNО3-, Na2CО3).

40