Определение тромбинового времени.

Принцип метода: Заключается в определении времени свертывания плазмы крови под влиянием тромбина стандартной активности.

Реактивы:

1. Тромбин (лиофильно высушенный, 150 ед. NIH во флаконе) – 2 флакона;

2. Буфер трис-HCI (концентрированный 20:1 раствор, 1 М), 5 мл – 2 флакона;

3. Контрольная плазма в состав набора не входит. Для получения контрольных значений ТВ следует использовать пул бедной тромбоцитами плазмы, полученной от 3-5 практически здоровых людей. Может быть также использована коммерческая контрольная нормальная плазма.

Оборудование:

• Коагулометр;

• Секундомер (при отсутствии коагулометра);

• Термобаня на +37 С;

• Пипетки вместимостью 0,1-1,0 мл; 5,0 мл;

• Пробирки стеклянные;

• Цилиндр мерный вместимостью 100 мл;

• Физиологический раствор (0,9%) хлорида натрия;

• Вода дистиллированная;

• Перчатки резиновые хирургические.

Приготовление анализируемых образцов.

При обследовании больных, получающих гепарин, рекомендуется предварительно очистить плазму от антикоагулянта.

Приготовление реагентов:

1. Разведение концентрированного буфера.

Поместить концентрированный буфер трис-HCI в мерный цилиндр и залить дистиллированной водой до 100 мл.

2. Разведение тромбина.

Во флакон с тромбином внести 5,0 мл 0,9 % раствора хлорида натрия и развести при комнатной температуре. В результате получают маточный раствор тромбина, который хранится при +2…+8 С до 30 дней.

3. Получение контрольной плазмы.

Бедная тромбоцитами плазма полученная по описанному методу ( см. выше раздел «Приготовление анализируемых образцов», смешивается в равной пропорции.

Ход определения:

К 0,2 мл плазмы, взятой в пробирку, прогреть 1 минуту. При работе на коагулометре в кювету внести и прогреть 0,1 мл плазмы. Добавить 0,2 мл прогретого тромбина и включить секундомер ( в другом варианте внести 0,1 мл тромбина и начать отсчет времени). В мануальном варианте отметить время свертывания при периодическом покачивании пробирки.

Оценка результатов:

Результат выражают в секундах, сравнивают время свертывания контрольной и исследуемой плазмы.

Норма: 14-17 секунд.

Клинико-диагностическое значение.

Укорочение ТВ свидетельствует о гиперфибриногенемии. Удлинение ТВ обусловлено следующими причинами: присутствие в крови быстродействующих коагулянтов; образование и накопление в крови продуктов деградации фибриногена/фибрина, обладающих антитромбиновой активностью; гипофибриногенемия; дисфибриногенемия.

Определение протромбинового времени.

Измерение проводят на коагулометре или мануально.

Принцип метода: Тромбопластин (III фактор, тромбокиназа) превращает протромбин плазмы крови в присутствии ионов кальция в активный фермент тромбин, трансформирующий фибриноген плазмы крови в нерастворимый фибрин. Измеряется протромбиновое время – время образования фибрина в плазме крови в присутствии ионов кальция и тромбопластина (растворимого экстракта из мозга кролика).

Реактивы:

1. Техпластин – лиофильно высушенная тромбопластин-кальциевая смесь из кроличьего мозга, на 5,0 мл суспензии – 4 флакона;

Международный индекс чувствительности (МИЧ) указан в Паспорте к набору.

2. Контрольная плазма - лиофильно высушенный пул плазмы крови не менее, чем от 20 здоровых людей, на 1,0 мл – 1 флакон.

Оборудование:

• центрифуга лабораторная;

• коагулометр (при его отсутствии секундомер, термобаня +37 С);

• пипетки на 0,1; 0,2; 0,25; 1,0 и 5,0 мл;

• пробирки стеклянные;

• вода дистиллированная;

• перчатки резиновые хирургические.

Приготовление реагентов:

1. Разведение Техпластина.

Во флакон с Техпластином внести 5,0 мл д.воды, встряхнуть и выдержать при +37 С 20 минут. Перед каждым определением реагент перемешивать во избежание выпадения осадка.

2. Разведение контрольной плазмы.

Во флакон с контрольной плазмой внести 1,0 мл д. воды и растворить при комнатной температуре. Разведенную плазму перед исследованием 25-30 минут.

Ход определения:

1. Определение контрольных (нормальных) показателей.

В кювету коагулометра или в пробирку внести 1,0 мл контрольной плазмы, инкубировать при 37 С. Добавить 0,2 мл прогретого Техпластина и начать отсчет времени свертывания до образования фибрина.

2. Аналогично определить протромбиновое время в образцах плазмы больных.

Оценка результатов:

Результат выражают по одному из следующих вариантов:

1. Отмечают протромбиновое время (ПВ) в секундах у больного с указанием значений, полученных при исследовании контрольной плазмы;

2. Рассчитывают протромбиновое отношение (ПО) по формуле:

ПО = ПВбольного / ПВ контрольной плазмы * k

K – нормализованный коэффициент. Значение k указано в Паспорте к набору.

В норме ПО составляет 0,9-1,3.

3. При контроле за непрямыми антикоагулянтами определяют Международное нормализованное отношение (МНО), исходя из ПО и МИЧ.

Последовательность расчета:

ПО = ПВ больного/ ПВ контрольной плазмы * k

МНО = ПО^МИЧ

Норма: на коагулометре 13-18 сек, при мануальной технике определения 14-19 сек.

Таблица пересчета ПО в МНО при чувствительности тромбопластина (МИЧ), равной 1,20.

ПО	МНО	ПО	МНО	ПО	МНО	ПО	МНО
0,7	0,65	2,6	3,15	4,5	6,08	6,4	9,28
0,8	0,77	2,7	3,29	4,6	6,24	6,5	9,45
0,9	0,88	2,8	3,44	4,7	6,40	6,6	9,63
1	1,00	2,9	3,59	4,8	6,57	6,7	9,80
1,1	1,12	3	3,74	4,9	6,73	6,8	9,98
1,2	1,24	3,1	3,89	5	6,90	6,9	10,15
1,3	1,37	3,2	4,04	5,1	7,06	7	10,33
1,4	1,50	3,3	4,19	5,2	7,23	7,1	10,51
1,5	1,63	3,4	4,34	5,3	7,40	7,2	10,69
1,6	1,76	3,5	4,50	5,4	7,57	7,3	10,86
1,7	1,89	3,6	4,65	5,5	7,73	7,4	11,04
1,8	2,02	3,7	4,81	5,6	7,90	7,5	11,22
1,9	2,16	3,8	4,96	5,7	8,07	7,6	11,40
2	2,30	3,9	5,12	5,8	8,24	7,7	11,58
2,1	2,44	4	5,28	5,9	8,41	7,8	11,76
2,2	2,58	4,1	5,44	6	8,59	7,9	11,94
2,3	2,72	4,2	5,60	6,1	8,76	8	12,13
2,4	2,86	4,3	5,76	6,2	8,93	8,1	12,31
2,5	3,00	4,4	5,92	6,3	9,10	8,2	12,49

Клинико-диагностическое значение.

Используются при оценке системы гемостаза в целом, степени нарушения печеночной функции (синтеза факторов коагуляции), степени насыщения витамином К. ПТВ позволяет оценить активность факторов свертывания I, II, V, VII и X.