Определение коли-титра почвы методом бродильных проб с использованием среды Кесслера.

Исследования проводят в три этапа. На первом этапе готовят следующие разведения: для чистых почв—от 1 : 10^-1 до 1 : 10^-4; для загрязненных — от 1 : 10^-3 до 1 : 10^-6. После тщательного перемешивания 1 г почвы по 1 мл полученной суспензии из различных разведений переносят в пробирки со средой Кесслера с поплавками. Посевы культивируют при температуре +43_С в течение 48 ч (при такой температуре дает рост E. coli только теплокровных).

На втором этапе исследования просматривают посевы на среде Кесслера.

Для установления показателя коли_титра почвы находят пробирку с наибольшим разведением почвы, в результате посева которой появились признаки брожения. Из пробирок с помутнением и газом делают высев на агар Эндо штрихом. Посевы сутки культивируют при 37 С.

На третьем этапе исследуют колонии, выросшие на среде Эндо. Для этого выбирают изолированные колонии, типичные для бактерий БГКП, готовят из них мазки, красят по Граму, микроскопируют. При обнаружении в мазках коротких грамотрицательных палочек проводят высев на среду Кесслера для подтверждения газообразования в чистой культуре.

Особую трудность представляет выделение сибиреязвенных спор из почвы, так как в ней находится огромное количество различных микроорганизмов, в том числе спорообразующих сапрофитных аэробов. Существующие бактериологические методы не всегда позволяют выделить возбудителя сибирской язвы из почвы. Основная трудность состоит в отделении спор от частиц почвы.

Из многих известных методов более надежным является метод предварительной подготовки пробы почвы по следующей технологии:

1) 100 г исследуемой почвы заливают 5–10$кратным объемом стерильного фосфатного буфера или воды;

2) шуттелируют взвесь в течение 20–30 мин, с последующим 5–8 минутным отстаиванием;

3) проводят фильтрование через 2–3 слоя марли;

4) прогревают полученную суспензию в водяной бане в течение 30 мин при температуре +70 С для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры;

5) переносят суспензию на поверхность МПА в чашках Петри для получения изолированных колоний, а из них чистой культуры;

6) полученной культурой заражают 5–10 белых мышей подкожно в дозе 0,1–0,2 мл;

7) проводят вскрытие павших мышей и выделяют чистую культуру возбудителя сибирской язвы из органов трупа (см. вклейку, ил. VII).

В настоящее время в бактериологии предложены и применяются менее трудоемкие методы, которые основаны на применении селективных питательных сред. В них вводят 200–500 ЕД/мл полимиксина в сочетании с триметопримом, которые подавляют рост сопутствующей микрофлоры, грамположительных и грамотрицательных бактерий (B. subtilis, B. сereus и E. coli).

Тема 12. Санитарно-микробиологическое исследование воды. Определение коли-титра и коли-индекса воды.

Вода является естественной средой обитания многих микроорганизмов. Особую опасность для здоровья человека и животных представляют патогенные бактерии, которые могут содержаться в ней.

Источниками загрязнения воды патогенными микроорганизмами являются выделения больных животных и людей, трупы животных, сточные воды, особенно с предприятий, перерабатывающих животное сырье и др.

Длительность выживания патогенных микробов в воде зависит от их вида, условий окружающей среды и может составлять от нескольких часов до нескольких лет. Так, возбудитель сибирской язвы может сохраняться в воде до 3 лет, возбудитель туберкулеза — до 1 года, возбудитель бруцеллеза — до 100 дней.

Имеется группа болезней, для которых характерен водный путь распространения (паратифы, лептоспирозы).

Таким образом, вода может стать источником распространения инфекционных болезней, возникновения эпидемий и эпизоотий. Для санитарно-бактериологической оценки воды проводят следующие исследования:

1) определение количества МАФАнМ в 1 мл;

2) определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ);

3) обнаружение в воде патогенных микроорганизмов проводят по эпидпоказаниям. Для санитарно-микробиологического исследования пробы воды отбирают из источника в объеме не менее 500 мл. Из открытых водоемов их набирают батометром. Батометр — стерильная емкость с пробкой, в металлическом каркасе и со свинцовым грузилом. На нужной глубине пробку открывают, подтягивая ее за веревочку. Воду из рек, озер отбирают с глубины 10–15 см от поверхности, а при небольшой глубине — на расстоянии 10–15 см от дна.

Для отбора проб водопроводной воды из крана набирают 500 мл в стерильные колбы с ватной пробкой с соблюдением правил асептики. Кран предварительно стерилизуют горящим спиртовым тампоном, затем в течение 10 мин спускают воду и только потом берут пробы, которые исследуют сразу или не позднее 2 ч с момента взятия. Если это невозможно, то их хранят не более 6 ч обязательно при температуре +1...+5_С в холодильнике.

Определение количества МАФАнМ в водопроводной воде. В чашку Петри с соблюдением правил асептики вносят 1 мл водопроводной воды без предварительного разведения, заливают расплавленным и охлажденным до температуры +50_С МПА (методом горячей заливки). Посевы инкубируют 24–48 ч в термостате при температуре +30_С. После указанного срока приступают к подсчету количества колоний, выросших как на поверхности, так и в глубине агара. Учитывают только те разведения, при посеве которых на чашках вырастает от 30 до 300 колоний.

При посеве воды без разведений количество бактерий в 1 мл воды будет равно количеству выросших колоний. При определении количества МАФАнМ в воде открытых

водоемов исследуемую воду предварительно разводят стериль - 1:10^-1 до 1 : 10^-4, из двух последних разведений вносят по 1 мл в стерильные чашки и заливают расплавленным и охлажденным до температуры +50_С МПА. После инкубирования при температуре +30_С в термостате в течение 24–48 ч подсчитывают количество колоний, умножают на степень разведения воды и определяют количество бактерий в 1 мл воды открытых водоемов. Учету подлежат чашки Петри, в которых выросло от 30 до 300 колоний. Колонии считают в каждой чашке отдельно, определяют среднеарифметическое число по двум чашкам. Полученное число умножают на степень разведения исследуемой воды и получают число бактерий в 1 мл воды.

Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ) воды.

Колититром называют наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка.

Колииндекс показывает число кишечных палочек в 1000 мл воды.

Кишечная палочка является постоянным обитателем кишечника человека и животных, следовательно, ее присутствие в питьевой воде является индикатором фекального загрязнения, поэтому она отнесена к санитарно-показательным микроорганизмам. Чем выше концентрация бактерий группы кишечной палочки, тем вероятнее присутствие в исследуемой воде патогенных бактерий, таких как сальмонеллы, возбудители дизентерии и холеры. Показатели КТ и КИ указывают на санитарное состояние воды, ее пригодность в качестве питьевой.

Коли-титр и коли-индекс определяют двумя методами:

1) метод бродильных проб;

2) метод мембранных фильтров.

При исследовании чистой воды удобнее пользоваться методом мембранных фильтров. Если вода содержит механическиечастицы, затрудняющие процесс фильтрации, лучше пользоваться бродильным методом.

Метод бродильных проб. Суть этого метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды в питательные среды накопления с индикатором и поплавками, инкубации ее при температуре +37_С, с последующим пересевом из забродивших пробирок на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и вычислении коли_титра воды по нормативам.

Данный метод основан на ферментативной способности БГКП расщеплять при помощи ферментов лактозу или глюкозу до кислоты и газа. Исследуемая вода засевается в различных объемах в глюкозопептонную среду с индикатором и поплавками, при наличии кишечной палочки появляется помутнение, меняется цвет индикатора (желтый цвет переходит в красный) и появляются пузырьки газа в поплавках. Воду методом бродильных проб исследуют в три этапа (три дня):

Первый день. Засевают водопроводную воду в объеме 333 мл (три объема по 100 мл, три — по 10 мл и три — по 1 мл). При этом вода в объемах по 100 и 10 мл засевается в колбы и пробирки соответственно — с 10 и 1 мл концентрированной ГПС, а посев воды в объеме 1 мл— в пробирки с 10 мл среды с нормальной концентрацией (готовят как концентрированную, но количество всех ингредиентов, кроме воды, уменьшают в 10 раз). Посевы исследуемой воды в средах ГПС культивируют в термостате 24 ч при температуре +37_С.

Второй день. Ведется учет результатов посева разных объемов воды, при котором:

-отсутствие помутнения, образования кислоты и газа в колбах и пробирках после посева воды свидетельствуют об отсутствии кишечной палочки в исследуемом объеме воды;

-помутнение питательной среды, изменение цвета индикатора на красный и появление газа в поплавках говорят о наличии кишечной палочки. Из каждого забродившего посева петлей делают пересев штрихом на агар Эндо, разделенный на сектора в чашках Петри, таким образом, чтобы появились изолированные колонии. Посевы культивируют 24 ч при температуре +37_С.

Третий день. Ведется учет результатов посева на агаре Эндо, при котором:

-отсутствие роста на агаре Эндо или наличие колоний, не характерных для БГКП, говорит о том, что кишечной палочки в посевах нет;

-из колоний, характерных для бактерий БГКП (красных с металлическим оттенком), готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Идентифицируют культуру по оксидазному тесту, положительную реакцию на этот тест дают БГКП, которые не учитываются. Наличие в мазках грамотрицательных бактерий с отрицательной реакцией на оксидазный тест позволяет дать положительный ответ на присутствие БГКП в исследуемом объеме воды.

Для установления свежего фекального загрязнения делают посев воды в желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым. Посевы культивируют при температуре +43_С для дифференциации кишечной палочки от хладнокровных, не растущих при такой высокой температуре. Наличие мути и газа указывает на присутствие в воде бактерий — показателей свежего фекального загрязнения.