4.5. Определение гонадотропной активности гипофиза рыб

Использование тест-объектов. До настоящего времени для определения количества гонадотропных гормонов в препаратах гипофизов используются различные реакции органов животных, получивших инъекцию исследуемых препаратов. Такой способ оценки содержания гормона носит название биологического тестирования, а используемые животные — тест-обьектов.

Наиболее удачным тест-объектом для оценки гонадотропной активности гипофиза рыб нужно считать обыкновенного вьюна (Misgurnus fossilis Linnaeus). В качестве положительной реакции используется созревание икры у самок вьюна, что делает этот тест наиболее близким к задачам рыбоводства. Вьюн соответствует всем основным требованиям, прежде всего — даёт чёткую и постоянную реакцию, что позволило провести количественные измерения и дать определение единицы активности рыбьего гипофиза — вьюновой единицы (BE). BE — это такое количество гонадотропного гормона, которое необходимо для того, чтобы вызвать через 30-50 ч после инъекции созревание икры и овуляцию у зимних самок вьюна с гонадами в IV-й СЗ, массой 35-45 г при температуре воды 16°С в лабораторных условиях.

Для определения активности исследуемого препарата гипофиза во вьюновых единицах несколько групп самок вьюна получают одновременно гипофизарные инъекции с различной дозировкой. Минимальная дозировка, давшая созревание, будет соответствовать BE. Такая методика позволяет оценивать и сравнивать содержание гонадотропного гормона в различных гипофизах.

Вторым тест-объектом, пригодным для оценки качества гипофизов рыб, являются различные виды лягушек (Rana temporaria, R.esculentci, R.ridibunda).

Резервирование лягушек и подготовка их для работ по тестированию. Количество лягушек, необходимое для выполнения работ по тестированию препарата ацетонированиых гипофизов, рассчитывают исходя из следующих моментов:

• из количества партий гипофизов, подлежащих тестированию:

• из количества вариантов тестирования препарата необходимо испытать три дозы

препарата: 0,2; 0,3 и 0,4 мг;

• из количества лягушек в каждом варианте не менее пяти лягушек,

• из числа повторностей тестирования каждой партии гипофизов.

При получении чётких результатов тестирования достаточно двукратного тестирования каждой партии гипофизов, при получении сильно варьирующих данных необходимо трёхкратное тестирование, при этом окончательным результатом считают средние данные.

Таким образом, перемножив цифровые данные перечисленных выше параметров, получают количество лягушек, необходимое для выполнения работ по тестированию в текущем сезоне.

Например: имеется 10 партий гипофизов, необходимо испытать на гонадотропную активность три дозы препарата гипофизов, каждую дозу инъецируют пяти лягушкам, каждую партию гипофизов тестируют по 3 раза: (10×3×5×3) = 450.

Для проведения работы по тестированию, без учёта отхода лягушек за период зимовки, необходимо иметь 450 самцов лягушек.

Заготовку самцов лягушек следует производить поздней осенью в местах концентрации их на зимовку. Следует отбирать лягушек средних размеров, не допускать травмирования животных при заготовке и транспортировке к месту зимнего резервирования.

Резервирование лягушек в зимний период (3,5–4 мес.) осуществлять в слабопроточных бассейнах (лучше всего в бассейнах на РЗ), либо в ваннах с ежедневной сменой воды при температурах (+1°)–(+5°С) и слабой освещённости. В каждой ёмкости лягушки должны занимать не более половины площади дна при уровне воды 20-30 см.

Подготовку тест-объектов для работы (перевод из зимнего состояния) осуществлять путём постепенного повышения температуры воздуха в помещении, где установлены ёмкости с лягушками, до комнатной в течение 4-5 суток. Лягушек в этот период содержат при естественном свете и уровне воды в ёмкости 5-10 см.

В период выведения тест-объектов из зимнего состояния максимальная плотность их посадки в ёмкости характеризуется распределением лягушек на дне в один слой при уровне воды в ёмкости 5-10 см.

В этот период необходима ежедневная двукратная смена воды в ёмкости с лягушками. Водопроводная хлорированная вода должна быть предварительно отстоянной в течение не менее 24 ч.

Биотехника тестирования препарата гипофиза рыб. Тестирование различных партий препаратов ацетонированных гипофизов рыб необходимо осуществлять ежегодно строго в одни и те же календарные сроки. Чувствительность тест-объектов к содержавшимся в препаратах гонадотропинам повышается по мере приближения сроков естественного размножения тест животных. Поэтому тестирование препаратов гипофиза в более поздние сроки, чем рекомендуемые, приведёт к получению существенно завышенных показателей их биологической активности, при тестировании в более ранние сроки — к заниженным показателям. Лучшее время март.

Тестирование препаратов гипофиза рыб необходимо производить в первой половине дня при температурах воздуха в помещении 18-22°С и осуществлять следующим образом:

• из партии ацетонированных гипофизов, подлежащей тестированию, отобрать 8-10

гипофизов, отличающихся цветом и величиной;

• взвеешь отобранные гипофизы на аналитических весах с точностью до 0,1 мг;

• тщательно растереть взвешенный препарат в фарфоровой ступке, постепенно

увлажняя перетираемую массу до получения гомогенной сметаноподобной

консистенции;

• рассчитать наиболее удобное для работы разведение растёртой дозы препарата физиологическим раствором. Например: имеем навеску десяти гипофизов в 175 мг. Составляем простую пропорцию и рассчитываем, какое количество физиологического раствора необходимо для того, чтобы в каждом миллилитре (1 мл) приготовленной суспензии содержалось 10 мг сухого препарата:

10 мг — 1 мл;

175 мг — х мл; х = 17,5 мл;

• довести объём суспензии растворённого препарата гипофизов до 17,5 мл и дать ей

настояться (при периодическом взбалтывании) в течение 11,5 ч при комнатной

температуре. После этого объём суспензии ещё раз измерить (в случае необходимости

добавить чистый физиологический раствор) и обозначить её условно - суспензия 1;

• суспензию 1 тщательно перемешать путём быстрого и многократного набора её в

шприц и выливания обратно в бюкс, взять шприцем ёмкостью 1 мл точно 1 мл

суспензии, вылить в сухой чистый бюкс, добавить 9 мл физиологического раствора и

хорошо перемешать. Полученную суспензию обозначить — суспензия 2. Каждый мл

суспензии 2 будет содержать 1 мг сухого препарата гипофизов;

• для инъецирования. Например 5 самцов лягушки дозой по 0,3 мг препарата

отмерить 5×0,3 = 15 мл суспензии 2 (предварительно хорошо её перемешать) и

добавить 3,5 мл физиологическою раствора. В результате получим суспензию 3,

каждый миллилитр которой будет содержать 0,3 мг сухого препарата гипофизов.

Суспензия 3 является «рабочей» суспензией. Каждому из 5 самцов лягушки вводят по 1

мл суспензии 3. Аналогичным образом из суспензии 1 приготавливают «рабочую»

суспензию для инъецирования лягушек дозами 0,2 и 0,3 мг препарата гипофиза;

• инъецируют лягушек в спинной лимфатический мешок и отсаживают в аквариум без

воды;

• реакцию спермиации проверяют через 30-40 мин после инъецирования, причём в

первую очередь проверяют лягушек, проинъецированных максимальными дозами;

• реакция спермации считается положительной, если в жидкости, взятой пипеткой из

клоаки лягушки, содержатся подвижные сперматозоиды (от десятка до многих тысяч в

поле зрения микроскопа). Наличие сперматозоидов определяют путём анализа пробы,

помещённой на предметное стекло, под малым увеличением микроскопа.

Показателем биологической активности испытуемого препарата является минимальная весовая его доза (например, 0,2, 0,3 и 0,4 мг), которая вызывает реакцию спермации у 80 или 100% проиньецированных тест-животных. Величину биологической активности препаратов гипофиза рассчитывают путём деления единицы (1 мг) на весовой показатель минимальной эффективной дозы, вызывающей созревание 80-100% тест-объектов.

Например: 1 (мг) : 0,2 (мг) = 5 (ЛЕ) или 1 (мг) : 0,3 (мг) = 3,3 (ЛЕ).

Полученная величина (частное) является показателем биологической активности испытуемого препарата и показывает, у какого количества тест-объектов можно вызвать специфическую реакцию 1 мг препарата. Чем больше лягушачьих единиц (ЛЕ) в 1 мг препарата, тем активнее гипофизарный препарат, тем меньше его весовое количество потребуется для созревания рыб-производителей в результате гипофизарной инъекции. Тестирование каждой партии гипофизов необходимо повторять не менее двух раз. При существенном расхождении результатов первого и второго тестирования (которое может быть в результате несоблюдения вышеуказанных рекомендаций), тестирование повторяют трижды, причём для каждого повторного тестирования берут новые навески препарата.

При тестировании гипофизов карповых, осетровых и судака в качестве тест-объекта можно использовать самок ерша и окуня (вьюн и лягушка не подходят для тестирования гипофиза судака, поскольку введение этим объектам гипофиза судака не вызывает положительной реакции).

В последние годы некоторые исследователи в России и в других странах успешно оценивают гонадотропную активность гипофизов рыб по созреванию и овуляции ооцитов амфибий и рыб in vitro. Этот метод обладает рядом преимуществ по сравнению с классическими методами тестирования. Он отличается большей чувствительностью и даёт более достоверные результаты, так как позволяет сравнивать действие на яйцеклетки одного и того же реципиента разных доз гипофиза, взятою от одного донора, или равных доз, полученных от разных рыб-доноров.

Представляет интерес метод Б.Ф. Гончарова, который заключается в следующем проба икры, взятой у самок с помощью щупа, выдерживается в смеси раствора Рингера для холоднокровных животных (NaCl — 6,5 г, КСl — 250 мг, СаСl2 — 300 мг и NaHCO3 — 2 г на 1 л дистиллированной воды) с 0,1 %-ным раствором кристаллического альбумина. При добавлении определённого количества гипофиза у икринок растворяется ядро. Наименьшее количество гипофиза, вызвавшее растворение ядра, является показателем активности гипофиза.