Лабораторные_Буракова

• на фильтровальной или хроматографической бумаге - сниженная конвекция, разделенные зоны можно зафиксировать и окрасить.

• на пленках из ацетата целлюлозы - быстрый, требует меньшего количества пробы для анализа. Низкая адсорбционная емкость помогает избежать появления “хвостов” на электрофореграмме. После окрашивания фон остается бесцветным. Пригодны для иммуноэлектрофореза.

• в крахмальном геле - первый носитель со свойствами молекулярного сита. Активно препятствует конвекции. Повышает разрешение.

• в агаровом и агарозном гелях - Удовлетворительная прозрачность, высокая пластичность (проще резать, удобнее красить и определять ферментативную активность прямо в геле), простота изготовления.

2.Как формируетсяхуйполиакриламидный гель?

ПААГ формируют путем сополимеризации акриламида (создающего линейную “основу”) и N, N′-метиленбисакриламида (служащего для поперечных “сшивок” линейных цепей).

Процесс полимеризации инициир ется персульфатом, (можно применять другие инициаторы, напр., рибофлавин и свет) и катализируется N, N,N′,N′- тетраметилэтилендиамином (TEMED).

При разрыве связи О-О образуются два свободных радикала, каждый из которых стимулирует разрыв двойной связи и присоединение молекулы акриламида, образуя свободные радикалы. Каждый такой радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи и присоединение следующей молекулы с образованием нового радикала, и т. д.

Цепная реакция полимеризации идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой, не образуют обычную ковалентную связь. По такому же механизму в растущую цепочку линейного полимера одной из своих концевых винильных групп может встроиться метиленбисакриламид.

Если его второй конец встроится в состав другой линейной полимерной цепочки, то образуется «сшивка».

В результате полимеризации получаются гели ячеистой структуры, размеры пор в которых зависят от концентрации мономеров. Каждый второй

углеродный атом линейной цепи содержит кислотную амидную группу, что обеспечивает гидрофильность полимера.

3.Из каких участков состоит приготовленный вами гель и для чего служит каждый из них?

Гель должен состоять из агарозной пробки, разделяющего геля, концентрирующего геля и лунок.

4.Как и для чего проводят электрофорез белков в денатурирующих условиях?

Когда требуется фракционировать белки исключительно по молекулярной

ферментов полностью или в значительной мере может быть утрачена из-за их денатурации.

массе, применяют ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях. Этот метод позволяетрекомбинантныхоценить количествоуйполипептидов в белковой смеси, при его использовании достигается очень четкое разделение зон, но активность

Денатурирующие условия создаются п тем обработки пробы трехкратным избытком додецилсульфата натрия, сокращенно – ДСН.

5.Как с помощью электрофореза можно определить молекулярную массу выделенных белков?

Молекулярные массы белков определяют, сравнивая их подвижность с подвижностью нескольких маркерных белков с известной молекулярной массой. Для калибровки гелей есть смеси из предварительно окрашенных и неокрашенных белков с точно известными молекулярными массами, смешанными для равномерного окрашивания.

Концентрированные растворы белков с известной молекулярной массой разводят соответствующим буфером образца и наносят на тот же гель, что и испытуемый образец. После проведения электрофореза и окрашивания геля измеряют пробег для каждой полосы белка от вершины геля. Вычисляют отношение расстояние пробега каждого белка к расстоянию пробега. Строят график зависимости молекулярных масс маркеров от полученных значений испытуемого образца.

Неизвестные молекулярные массы определяют с помощью метода линейной регрессии.

хуй