2.3 Непрямые методы (косвенные) диагностики иппп

Непрямые методы дают косвенную информацию о присутствии возбудителя в организме или о перенесенном в прошлом поражении искомым возбудителем - определяются антитела – иммунный ответ организма человека.

К методам непрямого выявления возбудителя относятся серологические исследования, основанные на выявлении антител, образовавшихся в процессе иммунного ответа макроорганизма на внедрение возбудителей инфекций. Определяемые антитела: иммуноглобулины классов А, М, G.Серологические исследования проводятся методами: -ИФА- иммуноферментного анализа, -РСК- реакции связывания комплемента, -РПГА- реакции пассивной гемагглютинации, -РИФ- реакции иммунофлуоресценции, -МИФ- реакции микроиммунофлуоресценции. В настоящее время на основании результатов серологической диагностики, без подтверждения другими реакциями, выставлять диагноз не представляется возможным, так как: -специфические антитела могут присутствовать и после ранее перенесенной инфекции, -многие ИППП обладают низкой иммуногенностью, -из-за особенностей иммунной системы некоторых пациентов, способной «выдавать» антительный ответ без клинических проявлений и наличия воспалительного процесса. При диагностике вирусных инфекций антительный ответ присутствует и у практически здоровых людей. В таких случаях целесообразно повторное исследование проб с интервалом в 2-3 недели.

Глава 3. Результаты и обсуждения

В данной работе приведен анализ методов лабораторной диагностики таких заболеваний передающихся половым путем, как сифилис, хламидиоз, гонорея, трихомониаз и кандидоз.

В настоящее время существует несколько методов диагностики инфекций передающихся половым путем.

Таблица 1. «Методы диагностики некоторых ИППП»

Инфекция	Методы диагностики
Сифилис	РИФ, РИБТ, РИП, ТРПГА, ИФА, ПЦР, ИБ
Гонорея	Общий мазок, выделение чистой культуры, РСК, ПЦР, ЛЦР
Хламидиоз	Общий мазок, РИФ,ИФА, ПЦР, ЛЦР
Трихомоноз	Общий мазок, посев на флору, ПЦР, ПИФ
Кандидоз	РИМ, РИФ, ИФА, РАГА, ПЦР

В Таблице 1 представлены методы диагносткии таких половых инфекций, как сифилис, гонорея, хламидиоз, трихомоноз и кандидоз. Инфекции имеют множество методов обнаружения, однако не всегда необходимо применение тех или иных диагностических методов в определенных ситуациях. Обычно для точного подтверждения диагноза используется в среднем два-три метода, хотя их для каждой инфекции имеется достаточно большое количество.

Таблица 2. «Методы диагносткии половых инфекций и их свойства»

Название метода	Время проведения	Чувствительность (%)	Специфичность(%)	Цена (руб)
Микроскопия мазка	2-3 часа	60-70	Около 70	350-600
Выделение вируса в культуре клеток	От 2 до 20 дней	85	Около 100	2000-3000
Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ)	6 часов	65-70	Около 90	600
Иммуноферментный анализ (ИФА)	1 день	Более 90	96–100	500
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)	3-6 часов	98	94	400-600
Реакции агглютинации (РГА, РПГА, РОПГА, РГАЭР и т.п.)	1 день	65-70	Около 90	300-700
Реакция связывания комплемента (РСК)	2 дня	65-70	Около 90	300
ДНК-гибридизация	5-7 дней	65-70	Около 90	1200
Лигазно-цепная реакция (ЛЦР)	Около 3 часов	94,7	99,8	-
Реакция имунной флуорисценции (РИФ)	Несколько дней	98,5	99,6	1600
Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)	До нескольких месяцев	40	90	2300
Иммунный блот (ИБ)	Несколько дней	до 100	100	1000

Таблица 2 содержит данные о свойствах основных методов диагностики инфекций передающихся половым путем. Следует отметить, что несмотря на относительную дешевизну, чувствительность, специфичность и быстрые сроки некоторых методов, для получения непосредственного результата необходимо сочетание нескольких из них, кроме того, методы идентификации могут быть неприменимы для всех половых инфекций, что также стоит учитывать исходя из специфики и вида микроорганизма.

Сифилис. Рациональна следующая система скрининга пациента на наличие сифилиса: первичное обследование – использование нетрепонемных (реация Вассермана, РИБТ) или трепонемных тестов (РПГА, ИФА) → в случае положительного или сомнительного результата –повторное исследование (ИФА, РПГА) для исключения внутрилабораторной ошибки → сомнительные и позитивные образцы исследуются в иммуноблоте (для подтверждения специфичности).

Рекомендуемый алгоритм обследования на гонорею в России и за рубежом практически не отличается. Общепризнанно, что оптимальным является проведение бактериоскопии (то есть после окрашивания препарат исследуют под микроскопом) с окраской по Граму в сочетании с культуральным методом. ПЦР-диагностика также применяется для точной идентификации возбудителя и входит в программу диагностики инфекционного заболевания.

Такая комбинация методов обеспечивает высокие показатели чувствительности и специфичности. Специфичность бактериоскопического исследования достигает 96-99%, это связано с тем, что данная бактерия имеет четкую морфологическую форму (в виде кофейного зерна), поэтому под микроскопом ее можно довольно точно определить.

Гонококк. К сожалению, в РФ культуральное исследование на гонококк в большинстве случаев не проводится, а основным методом обследования является однократная бактериоскопия по Граму, при высокой специфичности, чувствительность которой при диагностике гонореи у мужчин с симптомами уретрита достигает 98%, а без симптомов 40-50%. Эффективность выявления гонореи бактериоскопическим методом для женщин значительно меньше – 80-50%, а по некоторым наблюдениям и 40-23%. Таким образом, очевидно, что при такой диагностике гонококковой инфекции высок риск получения ложноотрицательных результатов, особенно у женщин. Для повышения эффективности диагностики гонореи в качестве дополнительного метода исследования на гонококк может рассматриваться ПЦР. ПЦР позволяет точно идентифицировать наличие возбудителя в пробе.

Хлимидиоз. Что касается диагностики хламидиоза, то здесь, по-прежнему, «золотым стандартом» считается культуральный метод. Чувствительность этого метода может быть повышена за счет пересевания, но даже в этом случае чувствительность метода составляет 60-90%.

По мнению ведущих российских специалистов Института Пастера (Санкт-Петербург), занимающихся изучением проблем диагностики хламидиоза, для выявления этой ИППП необходимо применение сразу трех методов: прямая иммунофлуоресценция (исследование препарата под микроскопом с использованием специфических антител к антигенам), культуральный метод и ПЦР. Используется и еще один метод диагностики — иммуноферментный анализ на наличие в крови специфических антител. При этом, в отличие от всех других ИППП, только для хламидий имеет смысл проводить иммуноферментный анализ на наличие в крови специфических антител, поскольку во всех остальных случаях генерализованный иммунный ответ на инфекцию возникает чрезвычайно редко.

Трихомониаз. Рекомендуемый алгоритм обследования на трихомониаз, по сути, ничем не отличается от алгоритма обследования на гонорею, представляя собой сочетание микроскопии и культурального метода, которое с наибольшей вероятностью обеспечивает получение достоверного положительного или отрицательного ответа при любой форме течения трихомонадной инвазии.

Ложноотрицательные результаты микроскопического исследования на влагалищные трихомонады неизбежны при безупречном проведении анализа, поскольку чувствительность этого метода даже в вагинальных препаратах составляет 40-80%, а в цервикальных мазках это простейшее обнаруживается у 60% пациенток с трихомониазом.

Проблема ложноположительных результатов наиболее часто применяемого в России микроскопического исследования на трихомонады с использованием окрашенных препаратов не менее актуальна, поскольку существуют объективные причины для гипердиагностики данного представителя простейших. Влагалищные трихомонады могут быть весьма вариабельны по размеру и форме, что нередко побуждает исследователя искать так называемые «атипичные формы», за которые могут быть приняты клеточные элементы, которые в процессе приготовления мазка в ряде случаев приобретают необычные морфологические характеристики. Таким образом, для повышения эффективности микроскопической диагностики следует учитывать трихомонады с характерной морфологией и характерной подвижностью.

«Золотым стандартом» для выявления трихомонад считается культуральный метод. К существенным недостаткам этого метода можно отнести – длительность проведения анализа и дороговизна. Кроме того есть ограничения по жизнеспособности самих исследуемых патогенов.

Наиболее достоверные результаты обследования на трихомонаду могут быть получены при сочетании как минимум двух методов: микроскопия мазка – культуральный метод или микроскопия мазка – ПЦР.

Иммунофлуоресцентный анализ также используется для диагностики трихомониаза, однако отрицательный результат при использовании этого метода не является абсолютным, необходимо проводить дополнительные исследования.

Кандидоз. Микроскопия мазков вагинального отделяемого в нативных и окрашенных по Грамму препаратах. Данный метод позволяет определить наличие гриба, его мицелия или спор; выявить наличие микробов – ассоциантов; определить принадлежность к облигатно–анаэробным видам или лактабактериям. Культуральный метод позволяет определить родовую и видовую принадлежность грибов, их чувствительность к антифунгальным препаратам, выявить степень колонизации, наличие сопутствующей бактериальной флоры. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) основан на обнаружении в исследуемом материале единичных молекул ДНК возбудителей. Это самый чувствительный метод диагностики инфекций, полезен для поиска возбудителей, невидимых в обычном мазке и плохо растущих на питательных средах.

Чаще всего ПЦР применяется для диагностики диссеминированных и глубоких форм заболевания (кандидоз), то есть анализ проводится совместно с исследованием крови, биоптатов глубоких тканей, стерильных сред организма.

Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет провести распознавание смешанных инфекций, которые вызваны бактериями и грибами рода Candida (кандидоз). Также ИФА проводят с целью оценки эффективности лечения заболевания кандидоз.

Таким образом, для точной и эффективной диагностики ИППП необходимо сочетание нескольких методов, поскольку некоторые из них способные выдавать ложноположительные или ложноотрицательные результаты в зависимости от стадии развития заболевания или наличия смешанных инфекций. Однако наиболее универсальным и точным и для непосредственной идентификации методом является ПЦР.

Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний:

1. Прямое определение наличия возбудителей. Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся прдуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специ- фического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний втех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10–1000 клеток в пробе (чувствительность иммуноло- гических имикроскопических тестов– 103 –105 клеток).

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагносцировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

5. Высокая скорость получения результата анализа. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени.

6. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики. ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания.

7. Доступность метода. Стоимость проведения ПЦР-диагностики достаточно невысока, что позволяет практическому любому применить ее соответствующем медицинском центре или учреждении.

Заключение

В данной работе исследованы методы идентификации по следующим инфекциям, передаваемым половым путем: сифилис, гонококковая инфекция, хламидиоз, трихомониаз и урогенитальный кандидоз.

В работе проведена морфологическая и физиологическая характеристика возбудителей этих инфекций, описана клиника и патогенез заболеваний, а также подробно изучены методы лабораторной диагностки.

Прогноз для лиц с инфекциями, передающимися половым путем в целом благоприятный. Практически все болезни, передаваемые половым путем, хорошо поддаются лечению при своевременном их выявлении. Без лечения некоторые из них могут приводить к незначительным нарушениям здоровья, но другие приводят к бесплодию, тяжелым поражениям сердца, сосудов, суставов. Некоторые из инфекций передающихся половым путем, могут протекать абсолютно бессимптомно, но при этом оказывать свое пагубное действие на организм.

Примерно в половине или большинстве случаев наблюдается одновременное заражение двумя и более венерическими заболеваниями. Именно поэтому развитие методов лабораторной диагностики и своевременной идентификации возбудителей становится все больше необходимо для здоровья населения.

Выводы

1. Эффективной схемой проведения лабораторной диагностики для сифилиса является нетрепонемные и трепонемные тесты (РПГА, ИФА), после которых назначается имунный блот и ПЦР.

2. Для гонореи используется бактериоскопия и ПЦР

3. Алгоритмом определения хламидийной инфекции и трихомониаза является культуральный метод и ПЦР.

4. Для урогенитального кандидоза применяется микроскопирование, ИФА и ПЦР.

5. Наиболее оптимальным, точным и универсальным методом диагностики ИППП является полимеразно-цепная реакция.

Список литературы

1. Клинические рекомендации. Дерматовенерология. Четвертое издание переработанное и дополненное. Российское общество дерматовенерологов. Москва, «Дэкс-Пресс», 2010 [под ред. А.А. Кубановой]

2. Скрипкин Юрий. Инфекции передаваемые половым путем.

3. Определитель бактерий Берджи /под ред. Дж.Хоулта, Н. Крига, П.Срита,Дж.Стейли,Ст.Уильямса.-М.:Мир,1997.

4. М.Б.Охапкин, М.В. Хитров, И.Н. Ильяшенко Инфекции передающиеся половым путем. Пособие для врачей и интернов. Ярославская государственная медицинская академия. Кафедра акушерства и гинекологии.2000

5. С.Т. Павлов, И. К. Шапошников, В.И. самцов, И.И. Ильин. Кожные и венерические болезни. Издательство «Медицина», Москва, 1975

6. Ю.К.Скрипкин, Г.Я.Шарапова, Г.Д.Селисский

7. Инфекции, передаваемые половым путем. Практическое руководство.

8. В.П. Адаскевич, В.М. Козин, Кожные и венерические болезни. Мед. Лит., 2006. - 672 с.:ил.

9. Аллергические и инфекционные заболевания кожи: Учебное пособие/Под ред. С.И. Данилова. - Спб: СпбГМА им. И.И. Мечникова, 2001 — 56 с.

10. С.С. Арифов Клиническая дерматология и венерология.

11. А.Н. Родионов, Грибковые заболевания кожи. Руководство для врачей.-СПб: Издательство «Питер», 2000

12. Дерматовенерология : учебник для студентов высших учебных заведений / В. В. Чеботарёв, О. Б. Тамразова, Н. В. Чеботарёва, А. В. Одинец. -2013. - 584 с. : ил.

13. Т. Фицпатрик, Р. Джонсон, К. Вулф, М. Полано, Д. Сюрмонд Дерматология атлас-справочник.

14. Кожно-венерические заболевания:учебное пособие для студентов высших медицинских учебных заведений /Е.С. Козорез... Москва. - «Владос-Пресс», 2005. - 173.

15. Кожные и венерические болезни. Руководство для врачей. В 4 томах. - Т. 4/Под ред. Ю. К. Скрипкина. - М.:Медицина, 1996. - 352 с.: ил.

16. Рациональная фармакотерапия заболеваний кожи и инфекций, передаваемых половым путем. Руководство для практикующих врачей. Под общей редакцией А.А. Кубановой, В.И. Кисиной. Москва Издательство «Литтерра»,2005

17. Соколовский Е.В. Кожные и венерические болезни: учебное пособие для студентов медицинских ВУЗов. – Спб.: Фолиант, 2008. - 520 с.

О.Л. Иванов «Кожные и венерические болезни»: Шико; Москва; 2006