Фиксация мазков.

Обработка мазков фиксирующими жидкостями, придающими форменным элементам стойкость по отношению к содержащейся в красках воде, которая без фиксации мазков гемолизирует эритроциты и изменяет строение лейкоцитов. Кроме того, фиксация, вызывая коагуляцию белка, прикрепляет препарат к стеклу.

Реактивы.

Химически чистый метиловый спирт (метанол) или 96° этиловый спирт, или денатурированный спирт, или смесь Никифорова, состоящая из равных количеств этилового спирта и серного эфира.

Лучшим фиксатором является метиловый спирт.

В метиловом спирте мазки выдерживают не менее 5 мин, а в этиловом и денатурированном спирте и смеси Никифорова — не менее 30 мин.

По окончании срока фиксации препараты вынимают пинцетом, сушат на воздухе или ополаскивают в банке с нейтрализованной дистиллированной водой и укладывают мазками кверху на стеклянный мостик для окраски.

Фиксация мазков по Яхонтовой.

Повышение качества фиксации этиловым спиртом за счет предварительной обработки его цитратом и оксалатом натрия.

Готовят 2 реактива.

1. В цилиндр емкостью 100 мл вносят 1,5 г цитрата натрия, приливают 1,5 мл дистиллированной воды, размешивают стеклянной палочкой и для ускорения растворения помещают цилиндр в горячую водяную баню. В полученный слегка мутноватый раствор приливают этиловый спирт до объема 100 мл и тщательно, в течение 5—8 мин, размешивают. При размешивании на дне цилиндра образуется клейкое белое вещество, тянущееся за палочкой.

Раствор оставляют в покое на сутки для отстаивания.

2. Реактив готовят так же, как и предыдущий, но вместо цитрата натрия берут оксалат натрия.

Прозрачные реактивы 1 и 2 через сутки после их приготовления сливают в равных количествах и в этой смеси фиксируют сухие мазки крови в течение 20—30 с, после чего их подсушивают на воздухе (можно и не сушить!) и окрашивают.

Фиксация мазков парами фенола (по Сюткину).

Получение хорошего качества фиксации мазков при отсутствии спирта.

Методика.

На дно эксикатора наливают жидкий фенол (90 весовых частей кристаллического фенола и 10 весовых частей дистиллированной воды) из расчета 100 мл на 1,4 л объема эксикатора.

Для сохранения формы эритроцитов, лейкоцитов и дифференцированной окраски зернистости лейкоцитов воздействие на мазки крови паров фенола должно продолжаться в зависимости от комнатной температуры строго определенное время: при температуре 16—18° — 20 мин, при 19—21°—10 мин, при 22—24° — 5 мин, при 25—27° — 3 мин.

По истечении этого времени мазки вынимают, раскладывают на столе намазанной поверхностью кверху. Время выветривания мазков должно быть не менее времени фиксации.

ОКРАСКА МАЗКОВ.

Краску следует готовить на воде нейтральной реакции.

Принцип.

К щелочным гематологическим краскам относятся метиленовый синий и его производные— азур I (метиленазур) и азур II (смесь равных частей азура I и метиленового синего),

к кислым — водорастворимый желтый эозин.

Азур-эозиновые смеси красок обладают высокой чувствительностью к реакции воды и поэтому применяемая для приготовления красителей и для смывания их дистиллированная вода должна иметь нейтральную реакцию, т. е. рН 7,0.

При кислой реакции воды клетки долго не прокрашиваются и имеют красный оттенок. При щелочной реакции эритроциты окрашиваются в серовато-синий цвет, а ядра и цитоплазма клеток — в очень темные цвета.

Определение рН воды.

Концентрацию водородных ионов (рН) воды определяют с помощью рН-метра, или индикаторных бумажек.

Нейтрализация дистиллированной воды.

Кислую воду подщелачивают по каплям 1% раствором карбоната натрия,

щелочную — подкисляют 1% раствором уксусной кислоты до тех пор, пока она не будет иметь рН 7,0.

Окраска по Романовскому

Принцип.

Окрашивание различных элементов клеток в разные цвета и оттенки смесью основных (азур II) и кислых (водорастворимый желтый эозин) красок.

3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чи­стого метилового или этилового спирта.

Раствор оставляют на 3—5 сут, часто взбалтывая для лучшего растворения краски.

Затем прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3—5 сут, периодически взбалтывая. Приготовленная таким образом краска хорошо сохраняется длительное время в темных бутылях в шкафу, где нет ни кислот, ни щелочей.

Вновь полученный или приготовленный раствор красителя Романовского перед употреблением оттитровывают, т. е. окрашивают несколько фиксированных мазков крови в течение 25—40 мин различно разведенной краской (1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). По хорошо окрашенному препарату устанавливают  нужное количество капель краски на 1 мл воды и время окрашивания.

Фиксированные мазки укладывают на мостик, состоящий из двух стеклянных палочек, уложенных на два противоположных края кюветы.

Затем мазки заливают разведенной краской, которую наливают на мазок возможно более высоким слоем. Окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха в помещении от 25 до 45 мин.

Если температура в помещении низкая или требуется быстрее окрасить мазки, то разведенную краску можно подогреть до 60—70° (до кипения доводить нельзя).

После окончания окраски краску смывают (но не сливают) сильной струей воды и ставят мазки вертикально в деревянный штатив для просушивания.

Разведенной краской можно пользоваться только в течение одного дня.

Окраска по Романовскому в модификации Филипсона.

Принцип.

Применение красителей-фиксаторов, которыми мазки крови в первый период одновременно фиксируются и частично окрашиваются, а во второй период, после разбавления красителей – фиксаторов дистиллированной водой, докрашиваются окончательно.

1.Одну часть готовой краски Романовского и 3 части этилового спирта (ректификата) тщательно смешивают. Краска сразу же пригодна к употреблению, но можно готовить ее и заранее.

2. Дистиллированная вода нейтральной реакции.

Методика.

Приготовленный краситель наливают на нефиксированный мазок, покрывая его полностью и через 1 — 1мин 30 сек, не сливая красителя, прибавляют к нему но каплям примерно столько же дистиллированной воды, следя за тем, чтобы вода при соединении с красителем не сливалась с мазка. Через 20—30 мин краситель смывают водой и мазок высушивают.

Окраска по Лейшману.

Способ Лейшмана отличается от предыдущего лишь применяемым красителем и продолжительностью периодов фиксации и окраски. При этом способе применяют краситель, получаемый растворением смеси азура I, метиленового синего и желтого водорастворимого эозина в количестве 0,2 г в 10 мл абсолютного метилового спирта.

Продолжительность фиксации неразбавленным красителем 3—4 мин, а окраски с равным количеством воды 5—10 мин.

Способы быстрой окраски мазков краской Романовского по Алексееву.

Принцип.

Одновременная фиксация и окраска мазков с применением для ускорения окрашивания по первому способу подогрева дистиллированной воды и по второму способу — подогрева разведенной краски Романовского.

Реактивы.

1. Разведенная краска Романовского (1,5 капли краски на 1 мл дистиллированной воды).

2. Краситель Лейшмана для второго метода (растворяют 4 г сухой краски в 1 л метилового спирта и хранят в темной посуде).

3. Чистый метиловый спирт.

4. Нейтральная дистиллированная вода.

5. Фильтровальная бумага.

Методика.

1. На сухой нефиксированный мазок наносят глазной пипеткой 6—10 капель краски Романовского, распределяя ее той же пипеткой равномерным слоем. Через 30 с другой пипеткой добавляют к краске по каплям удвоенное количество подогретой до 50—60° дистиллированной воды. Покачиванием препарата перемешивают краску с водой и оставляют на 3 мин в покое, затем смывают ее дистиллированной водой и высушивают мазок фильтровальной бумагой.

2. На сукой нефиксированный мазок наливают равномерным слоем 10—12 ка­пель краски Лейшмана. Через 20—30 с, не сливая краску, добавляют к ней нагретый до 50—60° раствор краски Романовского в количестве, способном удержаться на препарате. Через 3 мин, не сливая краску, смывают ее сильной струей дистиллированной воды и высушивают препарат фильтровальной бумагой.

Окраска по Нохту.

Принцип.

Воздействие на фиксированный мазок водного раствора смеси основной (азур II) и кислой краски (эозин).

Реактивы.

1. Раствор 1 г азура II в 1 л дистиллированной воды.

2. Раствор 1 г водорастворимого желтого эозина в 1 л дистиллированной воды.

Каждый из этих растворов хорошо перемешивают и оставляют созревать при ежедневном встряхивании на 10—14 дней.

Перед окрашиванием раствор красителя готовят смешиванием 25 мл раствора 1,

20 мл раствора 2 с 55 мл нейтральной дистиллированной воды

Методика.

Краситель наливают на фиксированный мазок, и окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха 25—45 мин. Затем краситель смывают и мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Паппенгейму — Крюкову.

Принцип.

Комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая—Грюнвальда и краской Романовского, дающая возможность очень хорошо дифференцировать составные части клеток.

Реактивы

1. Готовый краситель-фиксатор Мая—Грюнвальда, состоящий из эозин метиленового синего в метиловом спирте.

2. Свежеприготовленный раствор краски Романовского

(1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды).

3. Нейтральная дистиллированная вода.

При отсутствии готового красителя-фиксатора Мая-Грюнвальда его можно приготовить растворением 0,3-0,5 г сухой краски Мая-Грюнвальда в 100 мл чистого метилового спирта с добавлением (или без него) 50 мл чистого глицерина.

Краситель в обоих случаях созревает 4 дня при комнатной температуре.

Методика.

На нефиксированный мазок наливают пипеткой 10—15 капель готового красителя-фиксатора Мая—Грюнвальда, через 3 мин прибавляют по каплям столько же воды и продолжают окрашивание еще 1 мин, после чего краситель смывают водой и мазок высушивают на воздухе.

Затем на высушенный мазок наливают свежеприготовленный водный раствор красителя Романовского на 8—15 мин в зависимости от температуры в помещении, смывают краску водой и мазок высушивают на воздухе.

Этот способ окраски является наилучшим.

Окраска по Райту.

Принцип.

Применение специально приготовленного красителя-фиксатора, дающего наиболее четкую окраску зернистости гранулоцитов, особенно базофилов.

Реактивы.

Краситель-фиксатор: 1% раствор медицинского метиленового синего на 0,5% водном растворе двууглекислого натрия наливают в сосуд так, чтобы высота слоя не превышала 6 см, и нагревают в аппарате Коха при 100° в течение часа с момента образования пара. Затем жидкость охлаждают и фильтруют. Фильтрат при искусственном освещении в тонком слое должен иметь пурпурно-красный оттенок.

К 100 мл фильтрата прибавляют 500 мл 0,1% водного раствора эозина (желтого, водорастворимого). При смешении обеих жидкостей тотчас же образуется обильный осадок, который отфильтровывают и высушивают. Полученный краситель растворяют в чистом метиловом спирте в соотношении 0,1 : 60.

Методика.

На сухой нефиксированный мазок наливают несколько капель краски, спустя 1 мин прибавляют столько же капель дистиллированной воды. Через 2—3 мин препарат промывают в воде (около полминуты), пока он в тонком слое не приобретает розовый оттенок.

Приготовление и окраска толстой капли

Принцип.

Использование большего­ объема крови с целью улучшения условий обнаружения в крови малярийных плазмодий, спирохет возвратного тифа, эозинофилов

Реактивы.

1. Краска Романовского.

2. Дистиллированная вода.

Методика.

Приготовляют обычный мазок крови и на толстые места его наносят отдельно две большие капли крови. Каждую каплю концом иглы или углом другого стекла размазывают до величины двух- или трехкопеечной монеты и сушат на воздухе.

Мазок до нанесения толстых капель и после не фиксируют, а наливают на него на несколько минут дистиллированную воду для извлечения гемоглобина. Окрашенную гемоглобином воду затем осторожно сливают и на препарат наливают разведенную, как обычно, краску Романовского на 20—30 мин. После окраски препарат осторожно промывают водой, чтобы не смыть каплю, и высушивают на воздухе.

Больший объем крови, чем в мазках, и гемолиз эритроцитов позволяют легче обнаружить в крови малярийные плазмодии, спирохеты возвратного тифа, а также эозинофилы и полихроматофилы.

Клиническое значение.

Окраска патологической (токсигенной) зернистости нейтрофилов по Шмелеву.

Реактивы.

1. Дифосфат натрия.

2. Монофосфат калия.

3. Краска азур II.

4. Водорастворимый желтый эозин.

5. Дистиллированная вода.

6. Фильтровальная бумага.

Приготовление буферного раствора.

11,876 г высушенного в теплом месте в течение 5 сут двуводиого дифосфата натрия (Na2HP04*2H20) растворяют в 1 л дистиллированной воды;

9,078 г монофосфата калия (КН2Р04) также растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Для получения буферной смеси рН 5,4 0,4 мл полученного раствора дифосфата натрия смешивают с 9,6 мл раствора монофосфата калия.

Краситель готовят из 0,1% водного раствора азура II и 0,1% водного раствора водорастворимого желтого эозина. Смешивают 10 мл фосфатной буферной смеси с 2,5 мл 0,1% водного раствора азура II и 1,5 мл 0,1% водного раствора эозина.

Методика.

Мазок фиксируют в течение 4 мин в метиловом спирте, затем окрашивают в течение часа азуром II — эозином в фосфатной буферной смеси. После этого краску смывают дистиллированной водой и мазок просушивают фильтровальной бумагой.

Окраска патологической (токсигенной) зернистости по Фреифельд.

Принцип.

Применение  основной краски — карбол-фуксин-метиленового синего.

1. 1 г щелочного фуксина растворяют при слабом нагревании в 15 г 96° этилового спирта, охлаждают и к спиртовому раствору добавляют 100 мл 5% раствора карболовой кислоты.

2. 1% водный раствор метиленового синего.

Оба красителя можно хранить в отдельности практически неограниченное время.

Рабочую смесь готовят непосредственно перед окраской, так как она непригодна для хранения.

К 20 мл водопроводной воды приливают 7 капель первой краски, смешивают, прибавляют 5 капель второй краски и снова смешивают.

Методика.

Мазки крови, фиксированные 3 мин в метиловом спирте, красят 1 час рабочей смесью красителя, а затем краситель смывают водой и мазки высушивают.

Препарат, уже окрашенный по Романовскому, может быть окрашен этим способом без предварительного обесцвечивания.

_________________________________________________________________________

При тяжелой бактериальной инфекции в цитоплазме нейтрофилов могут появиться более крупные, чем в норме, гранулы - токсигенная зернистость нейтрофила

Наличие в цитоплазме нейтрофилов патологической зернистости имеет большое значение для оценки состояния больного при инфекционных процессах, при сепсисе, новообразованиях, интоксикациях и других заболеваниях.

_________________________________________________________________________

Окраска для выявления базофильной пунктации эритроцитов по Фреифельд

Принцип.

Базофильная зернистость эритроцитов хорошо воспринимает щелочной раствор метиленового синего.

Методика.

Мазок фиксируют в течение 3 мин в метиловом спирте, а затем окрашивают в течение часа раствором метиленового синего (5 капель 1% раствора на 20 мл водопроводной воды).

Краску смывают водой и мазок высушивают.

_______________________________________________________________________

Базофильная зернистость (пунктация) эритроцитов - гранулы сине-фиолетового или синего цвета, различного размера, располагаются чаще по периферии эритроцита, представляет собой остатки рибосом. Встречаются при интоксикации свинцом или тяжелыми металлами, талассемии, алкогольной интоксикации, цитотоксическом действии лекарственных препаратов, тяжелых анемиях.

_________________________________________________________________________

Базофильную пунктацию можно обнаружить и в мазках крови, окрашенных обычными способами по Романовскому, Паппенгейму—Крюкову и др.