Середовища

В багатьох випадках мікроскопічна діагностика не задовольняє потреби клініцистів. Використання мікологічного методу дослідження дозволяє визначити кількість клітин гриба в досліджуваному матеріалі, вид збудника та його чутливість до антимікотиків, що відіграє вирішальну роль при лікуванні

хворого.

Харкотиння перед дослідженням гомогенізують, струшуючи його в склянці із стерильним скляним намистом. Якщо харкотиння містить багато слизу та погано гомогенізується, до нього слід додати 1-2 мл стерильного фізіологічного розчину. Харкотиння мікроскопують в нативних та фарбованих препаратах. Якщо при мікроскопії у препаратах знаходять елементи гриба то таке харкотиння слід висівати у співвідношенні 1:10, 1:100, 1:1000. Розводять харкотиння у рідкому поживному середовищі ( сусло, Сабуро, 1% пептонна вода) або в фізіологічному розчині. 0,1 мл з кожного розчину вносять у центр чашки Петрі та стерильним шпателем розтирають по поверхні середовища. Кожний посів роблять на дві чашки. Посіви інкубують у термостаті при 37°С 48 годин.

Промивні води бронхів, промивні води гайморових пазух, жовч, ексудати, шлунковий сік, сечу переносять у центрифужні пробірки та центрифугують при 1500 обертах за хвилину. З

10

осаду готують нативні препарати для мікроскопії. Якщо при мікроскопії дріжджові клітини, що брунькуються, знаходять у кожному полі зору, то проводять посів у двох співвідношеннях 1:100, 1:1000 по 0,1 мл на поверхню щільного поживного середовища шпателем. Якщо при мікроскопії дріжджові клітини не виявляють, то матеріал засівають без розведення. Інкубують при 37 °С 48 годин.

Кал переносять у кількості 1 г в пробірку з 9 мл фізрочину, емульгують, залишають на 5-Ю хвилин для осадження великих частинок. Із отриманого розчину 1:10 готують розчини 1:100, 1:1000 і висівають по 0,1 мл на чашку Петрі.

Ліквор перед посівом обов'язково мікроскопують. Готують три препарати: 1)нативний - у краплі стерильного фізрочину, 2)нативний - у краплі туші, 3) мазок, забарвлений за Грамом. Мікроскопія матеріалу допомагає виявити наявність дріжджових клітин, що брунькуються, фрагментів міцелію гриба або бактерії, які викликають гнійний менінгіт (менінгокок, пневмокок, гемофільна паличка). Наявність змішаної флори свідчить про контамінацію отриманого матеріалу. В препараті з тушшю можна виявити гриб Сryptococcus neoformans у якого навколо округлих клітин буде зона просвітлення ( за рахунок капсули), а навколо грибів Саndida такої зони не буде. Посів ліквору проводять після мікроскопії осаду на 3 чашки Петрі з Сабуро - агаром, а також на рідке середовище Сабуро. Поживні середовища необхідно приготувати безпосередньо перед посівом і підсушити в термостаті. На поверхню поживного середовища чашок №1 та №2 наносять по 2-3 краплі осаду з ліквору та ретельно втирають шпателем, а у центрі чашки №3 проводять посів у трьох зонах по 1 краплі. Ліквор, що залишився, переносять в 5 мл рідкого сусла або бульйону Сабуро. Посіви інкубують при двох температурних режимах: чашку №1 в термостаті при 37°С, чашки №2 та №3, а також посів на рідке середовище при 28-30°С. Посіви при температурі +37⁰С переглядають на 2-й та 5-й день, а при температурі 28-30°С на 4-й, 7-й, 10-й день росту. Якщо на 5-й день при

11

температурі +37°С та на 10-й день при температурі 28-30⁰С росту немає, проводять висів з рідкого поживного середовища на чашки з сусло- або Сабуро-агаром. У разі відсутності росту дріжджової флори результат реєструють як негативний.

Виділення з свищів. Дослідження починають з мікроскопії матеріалу в нативних та забарвлених препаратах, якщо виділення інтенсивні. Потім проводять посів матеріалу на щільні поживні середовища (сусло або Сабуро), для цього на чашку наносять 2-3 краплі виділень та шпателем втирають у поверхню середовища. Посіви інкубують упродовж 48 годин при 37°С.

Виділення слизових. Тампон вносять у пробірку з 5 мл рідкого середовища (сусло, Сабуро, МПА) зі скляним намистом та струшують 5-7 хвилин. Із отриманої суміші готують розчини 1:10, 1:100 та висівають по 0,1 мл кожного розчину на дві чашки поживного середовища. Посіви інкубують при 37°С. Через 48 годин підраховують кількість колоній та визначають кількість дріжджових клітин на тампон. Для цього кількість колоній перемножують на 50 та на розчин. У разі відсутності росту дріжджових колоній на чашці Петрі з розчину роблять повторний висів з середовища-збагачення на одну чашку з сусло-агаром. Виділення, отримані тампоном, можна посіяти просто проводячи тампоном по поверхні поживного середовища. При цьому кількість колонії не рахують, а лише відмічають наявність росту: одиничні колонії, значний ріст або відсутність росту.

Кров. 5 мл вносять в 50 мл поживного середовища (бульйон Сабуро з 2% глюкози або середовище Кітта Тароцци). Для посіву можна брати кров з антикоагулянтом або таку, що згорнулася. Посіви інкубують 10 днів при 37 °С з контрольним висівом на 5-ту та 10 - ту добу. Стерильною піпеткою збирають осад, 3 краплі якого розсівають бактеріологічною петлею по поверхні сусло-агару. Засіяні чашки витримують у термостаті з температурою +37°С 2-5 діб. Можливий інший варіант посіву крові на мікрофлору. У цьому випадку 5 – 10 мл крові засівають краплями. На поверхню щільного поживного середовища

12

піпеткою наносять 40-50 крапель крові на відстані 0,5 см між краплями. Посів проводять у двох послідовностях, один варіант інкубують при температурі +37°С, а інший при кімнатній температурі упродовж 2-5 діб.

Шматочки органів та тканин притискають до поверхні щільного середовища, потім проводять розсів петлею. Цей самий шматочок вносять у 50 мл рідкого середовища. Посіви інкубують при 37°С упродовж 5 днів.

Нігті та лусочки шкіри - спочатку мікроскопують. Для мацерації до нігтів додають 20% розчин КОН та прогрівають над полум'ям спиртівки до появи кристалів лугу по краю краплі. Потім краплю накривають накривним склом та мікроскопують спочатку на малому збільшенні з об'єктивом на 8, окуляром на 10 для пошуку лусочок. Потім розглядають лусочку при великому збільшенні з об'єктивом на 40 та окуляром на 10. Посів лусочок проводять незалежно від результату мікроскопії. Стерильною мікологічною лопаткою лусочки переносять у пробірку на скошений сусло-агар у 2-3 ділянки, притискуючи до поверхні середовища. Посів краще проводити у 2-3 послідовностях. Інкубують при температурі 28-37°С упродовж 2-5 діб.

3-й етап дослідження — вивчення культуральних та біохімічних властивостей

Після інкубації оцінюють характер росту мікроорганізмів та підраховують кількість колоній з метою визначення ступеня осіменіння матеріалу. Розрахунок кількості дріжджоподібних клітин в 1 мл рідкого матеріалу проводять за формулою n=аЬс, де а - середня кількість колоній на одній чашці Петрі; b - об'єм висівного матеріалу (0.1 мл) в 1 мл висівного матеріалу (* 10) с-ступінь розведення висівного матеріалу. Вивчають культурально-морфологічні ознаки виділених дріжджоподібних мікроорганізмів. На щільних поживних середовищах у С. аlЬісапs колонії середнього розміру білого або блідорожевого кольору гладкі, вологі, з рівними краями, сметаноподібної консистенції. У інших видів колонії можуть бути дрібні або великі, сірі, жовтуваті, їх поверхня може бути кожестой або

13

зморшкуватою. В рідких поживних середовищах реєструють характер росту у вигляді кільця або плівки на поверхні (тонка, суха, слизова, кожеста), осаду (тонкий, незначний, значний, схожий на пластівці). Із типових колоній готують нативні препарати з метою перевірки наявності дріжджових клітин.

Наступним етапом є проведення тесту на росткові трубки, який дозволяє швидко ідентифікувати С. аlЬісапs Існує декілька варіантів проведення даного тесту, ми наводимо найбільш простий варіант його проведення. У пробірку з сироваткою крові у кількості 0,2-0,5 мл вносять культуру грибів, що досліджують. Отриману суміш інкубують при 37°С 2-3 години. Потім із суміші готують нативні препарати та мікроскопують їх на великому збільшенні (об'єктив на 40х та окуляр на 10х). При позитивному результаті в препараті ми будемо спостерігати дріжджоподібні клітини, які мають вирости у вигляді трубки, якщо ці вирости рівномірні по всій довжині та не мають звужень, їх називають ростковими трубками. У разі наявності даних виростів, ми визначаємо такий мікроорганізм, як Саndida аlЬісапs У 90% випадків С. аlЬісапs дають позитивну пробу на росткові трубки.

Гриби, які дали позитивну росткову пробу, необхідно проінкубувати при 45°С для ідентифікації С.dubliniensis яка відрізняється від С. аlЬісапs лише тим, що не росте при цій температурі. Гриби, які дали негативний тест на росткові трубки, накопичують та продовжують вивчення їх здатності ферментувати та асимілювати різні субстрати, а також вивчають типи росту грибів.

Хламідоспороутворення та типи філаментації вивчають на рисовому, кукурудзяному або картопляному середовищі. Для цього в чашку з поживним середовищем в одну точку наносять мікологічною лопаткою або петлею біомасу гриба та проводять з неї посів штрихом, трохи прорізаючи агар та рівномірно розподіляючи біомасу гриба по всій довжині штриха. Штрих можна накрити покривним склом. Чашки з посівами інкубують у термостаті при 28°С 24-48 годин. Для перегляду посівів чашку ставлять на предметний столик. З

14

метою економії поживних середовищ утворення хламідоспор та типи філаментації можна вивчати на блоках картопляного або рисового агару. При цьому 0,5 мл розплавленого та охолодженого до 40°С агару стерильною піпеткою наносять на стерильне предметне скло та вносять петлю досліджуваної культури. Після перемішування петлею агар накривають стерильним накривним склом. Скельця з агаром ставлять у стерильну чашку Петрі, на дно якої кладуть фільтрувальний папір, змочений стерильною водою. Закриту чашку інкубують при 37°С 48 годин та мікроскопують на малому збільшенні.

Хламідоспори мають вигляд округлих клітин з двоконтурною стінкою, розміром 10-20 мм, інколи із зернистим вмістом, їх утворюють лише Саndida аlЬісапs. Найчастіше хламідоспори локалізуються на кінцях псевдогіф, рідше - на бокових гілках. Псевдоміцелій утворюється в результаті незакінченого брунькування: дочірня клітина, що утворилася, зберігає зв'язок з материнською за рахунок вузького перешийка, утвореного із зовнішніх шарів клітинної стінки. По ходу псевдоміцелію за рахунок мультиполярного брунькування можуть утворюватися бокові нитки та формуватися їх скупчення (гломерули) різної форми за рахунок поділу дріжджових клітин (бластоспор). Залежно від виду гломерул та їх розміщення по відношенню до псевдоміцелію виділяють п'ять типів росту: кулястий (Мусоtorula), крилоподібний (Мусоtoruloides), ланцюговий (Сandidа), рудиментарний (Мусосаndida) та деревоподібний (Blastodendron). Морфологія типів росту динамічна: через деякий час на місці типу Саndida можуть виникнути інші типи росту.

Ферментація вуглеводів. До проведення тестів на ферментацію вуглеводів існують певні вимоги - необхідно використовувати свіжі 1-2 добові чисті культури грибів (чистота перевіряється розсівом та мікроскопією окремих колоній), високоочищені реактиви (х.ч., ч.д.а.) та дотримуватися оптимальної температури. Спеціальні середовища розливають у пробірки із скляними поплавцями. Вносять культуру та інкубують при 28⁰С упродовж 2-7 діб. Посів слід переглядати

15

кожного дня. Про утворення кислоти свідчить зміна кольору середовища (при додаванні реактиву Андреде відмічається почервоніння, при додаванні бромтимолового синього -середовище жовтіє), про утворення СО₂ свідчить пухирець газу у поплавці. Результат реєструють як позитивний при появі газу у поплавці.

Асиміляція вуглеводів. Для перевірки асиміляції вуглеводів в умовах практичної лабораторії, на нашу думку, краще застосовувати метод паперових дисків. Для цього у стерильні чашки Петрі наливають по 2 мл густого зависі грибів роду Саndida а зверху наносять 18-20 мл розплавленого та охолодженого до 40⁰С мінімального середовища. Вміст чашки перемішують. Чашки підсушують у термостаті 1 годину. Попередньо приготовлені з фільтрувального паперу круглі диски (сі -0,5 см) стерилізують та змочують 20-30% розчином вуглеводів, висушують 2-3 доби та накладають на поверхню мінімального середовища. Слід використовувати щонайменше 6 вуглеводів: глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, рафінозу, галактозу, їх розміщують за схемою та позначають цифрами. Посіви інкубують при 37°С, результати реєструють через 48 годин. Як контроль використовують ріст гриба навколо диска змоченого розчином глюкози. Ауксографічний метод може бути виконаний за типом чашкового методу титрування антибіотиків, коли в агарі вирізають циліндром луночки, в які вносять по 0,1 мл 10% розчину вуглеводів. Аналогічно вивчають асиміляцію азотистих речовин: нітратів, сечовини, гуаніну, оксипроліну, які можуть бути доказовим доповненням при характеристиці біохімічної активності аспорогенннх дріжджів.

Окрім класичних схем ідентифікації грибів, існує ряд альтернативних методик. Останнім часом значного поширення набули тест-системи для видової ідентифікації мікроорганізмів. Принцип їх роботи ґрунтується на проведенні мікрореакцій ферментації чи асиміляції вуглеводів та азотистих речовин з індикацією результату реакції у вигляді зміни кольору реактиву. Безперечно, що використання таких тест-систем значно

16

спрощує та прискорює видову ідентифікацію грибів, єдиним негативом є висока вартість таких визначень.

Іншим альтернативним методом видової ідентифікації грибів є використання спеціальних селективних середовищ, які містять хромогенні субстрати. Під час росту на такому середовищі колонії грибів забарвлюються у різні кольори залежно від виду гриба, що пов'язано із різною біохімічною активністю. Прикладом таких середовищ є ”Кандіселект”, „Бластезис”

4-й етап - визначення чутливості грибів роду Саndida до антимікотичних препаратів

У центрі уваги дослідників в останні 15 років було створення та впровадження в практику єдиної стандартизованої методики визначення чутливості грибів до антимікотиків. Неодноразово говорилося про складність тестування грибів на чутливість до антимікотиків навіть при абсолютній точності проведення методик, використанні тест-штамів, виконанні умов зберігання тест-систем та строків їх реалізації. Для визначення чутливості до протигрибкових препаратів використовують різні методики: метод серійних розведень на рідкому поживному середовищі, Е-тест, метод розведення антимікотиків у агарі, диско-дифузійний метод та використання різних тест-систем. Як стандарт для порівняння різних методів національна комісія із стандартів у США (NCCLS) розробила еталонний метод М-27-А. Слід зазначити, що будь-який інший метод, який дає результати, які відповідають результатам, отриманим стандартним методом, можна розглядати як альтернативні методу М-27-А.

Чутливість грибів до антимікотиків визначають на спеціальних середовищах. Відомо, що універсальних середовищ не існує. Для грибів краще використовувати середовище RPMI 1640 (за рекомендацією NCCLS), але можна Сабуро і МПА із додаванням 1% глюкози.

Існує два варіанти проведення методу М-27-А: метод макророзведень та мікророзведень.

Метод макророзведень. Для його проведення використовують середовище RPMI 1640 з b-глютаміном і без

17

бікарбонату натрію. Для його виготовлення використовують буфер з рН 7.0 із 0.165 М морфолінпропансульфонової кислоти.

Процедура проведення: розчини протигрибкових препаратів можна приготувати заздалегідь у концентрації 1280 мг/мл-1. Протигрибкові препарати , які не можна розчинити у воді, а саме: кетоконазол, амфотерицин В, ітраконазол, флуконазол розчиняються серійно в диметилсульфоксиді. Отриманий вихідний розчин антимікотиків десятикратнократно розводять у середовищі RPMI 1640. Маленькі об'єми стерильних розчинів вносять у стерильні поліпропіленові або поліетиленові пляшечки, обережно запечатують та зберігають при Т 60°С або -20°С. Для приготування розведень протигрибкових препаратів використовують стерильні пробірки. Для кожного визначення робоча концентрація антифунгальних препаратів буде в 10 разів меншою від початкової концентрації після того, як туди буде внесено інокулюм. Культуру для проведення аналізу вирощують на агарі Сабуро або декстрозо-пептонному агарі при 35⁰С 48 годин. Інокулюм готують* так: вміст 5 колоній діаметром 1 мм вносять у пробірку з 5 мл стерильного 6,85% NаСl та збовтують. Оптична щільність утвореної суспензії має відповідати 0,5 стандарту Мак-Фарланда. Це буде відповідати концентрації 1-5*10*⁶ кл/мкл. Робоче розведення клітин готують 1/100 або 1/20 від вихідного розведення, вносячи суспензію в середовище RPMI 1640 з кінцевою концентрацією 0,5-2,5* 10*³кл/мл-1. До 0,9 мл інокулюму у пробірки додають 0,1 мл різних розведень протигрибкових препаратів, при цьому кінцева концентрація антимікотика повинна бути від 0,00313 до 16 мг/мл-1 для амфотерицину В, кетоконазолу, ітраконазолу та від 0,125 до 64мг/мл-1 для флуцитозину та флуконазолу. Контроль росту містить 0,9 мл суспензії грибів та 0,1 мл середовища без антимікотика використовують для кожного ізольованого тесту. Контроль стерильності - 1 мл середовища без грибів та препарату. Контрольні штами - С. parapsilosis СВS 604 (АТТС 22019), С.krusei СВS 578(АТТС 6258), С. аlЬісапs. АТТС 90028 та С.

18

аlЬісапs. АТТС 24433, С.parapsilosis АТТС 90018, С.tropicalisСВS 94(АТСС 750) використовують кожного разу при проведенні досліджень. Усі пробірки інкубують при 35°С 46-50 годин без перемішування, облік результатів проводять, якщо е каламутність в контролі росту. Для кетоконазолу, ітраконазолу, флуцитозину та флуконазолу, амфотерицину. В МІК визначається як найменша концентрація ліків, яка дає відсутність росту.

Метод мікророзведень. Принцип цього методу аналогічний методу макророзведень, різниця між ними лише в об'ємі рідини, який використовують, і фактично метод мікророзведень виконується, використовуючи стерильні одноразові пластинки, які містять контейнери з малою кількістю розчинів ( 96- лункова пластинка). Модифікаціями мікрометоду М27-А є комерційні набори "Fungitest" та "АТВ-Fungus".

Виконання даного методу в звичайній лабораторії складне та вимагає великих матеріальних затрат, що не дозволяє використовувати його в повсякденній практиці. Можна використовувати його модифікацію, адаптовану до наших умов, - метод серійних розведень.

Метод серійних розведень у рідких та щільних середовищах. Реакція проводиться у асептичних умовах з використанням стерильних піпеток для кожного інгредієнта реакції. Титрування можна проводити в рідких та щільних поживних середовищах. Беруть 10 стерильних пробірок, в які вносять 0,9 мл поживного середовища. Потім в першу пробірку вносять 0,1 мл 1% розчину антимікотика, перемішують і після цього 0,1 мл суміші переносять у другу пробірку, знову перемішують та переносять ту саму кількість з другої в третю і так далі до восьмої пробірки, з якої такий самий об'єм виливають назовні. Останні дві пробірки використовують як контроль, вони не містять антимікотика. Після цього в кожну пробірку, крім останньої, яка є контролем середовища, вносять 0,1 мл суміші клітин (25 000 клітин) досліджуваної культуру, штатив із пробірками струшують та ставлять у термостат на

19

18-24 години при температурі 37⁰С. По закінченню зазначеного часу проводять облік результатів, за наявності помутніння говорять про негативний результат, за відсутності помутніння -про позитивний результат. Про мікробоцидний ефект говорять, якщо перші чотири пробірки залишаються прозорими, статичний ефект реєструється, якщо прозорими залишаються 6 пробірок.

Диско-дифузійний метод. Для визначення чутливості дріжджів до антимікотичних препаратів готують суміш 24-48-годинної культури у ізотонічному розчині за стандартом мутності 5 ОД. 1-2 мл даної суміші наливають на поверхню агаризованого середовища Сабуро у чашці Петрі та рівномірно розподіляють суміш по поверхні поживного середовища. Піпеткою видаляють надлишок, підсушують відкриті чашки при кімнатній температурі 15 -ЗО хвилин. Диски розміщують на однаковій відстані один від одного на поверхні агару. Як контроль використовують диск, змочений розчинником. Чашки інкубують при 37°С 2 доби. Облік результатів проводять вимірюючи лінійкою діаметр зони затримки росту мікроорганізмів і порівнюють результати, отримані при цьому, з відомими стандартами. Цей метод зручний у використані та, на жаль, він не дає високої достовірності отриманих результатів.