3. Індикація вірусів в культурі клітин.

Для індикації вірусів у культурі клітин можна застосовувати метод бляшок. Це обмежені осередки загиблих під дією вірусу клітин у суцільному моношарі культури. Для одержання бляшок культуру клітин, вирощену в матрацах, промивають розчином Хенкса і зара-

жають вірусом (у невисокій концентрації). Після контакту 1 — 2 год при +37 °С видаляють вірусовмісну рідину і вносять спеціальне агарове покриття, до складу якого входять такі компоненти: агар розчин Ерла, сироватка крові ВРХ, натрію гідрокарбонат, антибіотики

та індикатор нейтральний червоний. Усі компоненти змішують у певному співвідношенні за температури +50...+55 °С. При нашаруванні на культуру середовище охолоджують до +37 °С. Через 30 - 60 хв після застигання середовища матраци вміщують у термостат

при +37 °С, загорнувши у світлонепроникний матеріал, бо індикатор має фотодинамічний вплив на клітини і за доступу світла може інгібувати утворення бляшок. Інкубацію проводять клітинами догори. Спостерігають за появою бляшок упродовж 4-12 діб

4.Титрування вірусів за гемоглютинувальної дією.

Гемаглютинація — це здатність вірусів склеювати еритроцити за рахунок білка гемаглютиніну, який знаходиться в капсидній абосу-перкапсидній оболонці віріонів (залежно від складності їхньої організації). Механізм гемаглютинації полягає в адсорбції віріонів на поверхні еритроцитів і утворені «містків» між ними, внаслідок чого

еритроцити склеюються й осідають на дно пробірки або лунки планшета у вигляді «парасольки». Неаглютиновані еритроцитиосідають у вигляді «ґудзика» Процес гемаглютинації може бути оборотним. Віруси, що адсорбувалися на еритроцитах, можуть

звільнитися з їхньої поверхні під дією вірусного ферменту нейрамінідази. Кожний гемаглютинувальний вірус здатний склеювати еритроцити тварин і птахів певних видів за відповідної температури рН середовища РГА дає змогу швидко виявити гемаглютинувальний вірус в пат матеріалі від хворих тварин і заражених в лаб. Тварин в ембріональних рідинах заражених КЕ і культуральній рідині індукованих культур клітин в РГА визначають гемаглютинувальний титр вірусу.

Білет 15

2. Спадкова мінливість вірусів: мутації. Мутації— це спадкові зміни у вірусів, які полягають у порушенні генетичного коду. Можливі заміни, випадіння(делеції), вставки і перестановки нуклеотидів або їхніх пар в одно- і дволанцюгових молекулах нуклеїнової кислоти. Розрізняють спонтанні та індуковані мутації. Спонтанні мутації виникають у природі під впливом на генетичний матеріал вірусів різних природних мутагенних факторів, а індуковані— з’являються в експерименті. При класифікації мутацій використовують два різні підходи: 1) за зміною генотипу; 2) за зміною фенотипу. За зміною генотипу мутації поділяються на генні, або крапкові, що локалізуються в індивідуальних генах, і делеційні, які займають значні ділянки вірусного геному. За зміною генотипу мутації поділяються на генні, або крапко­ві, що локалізуються в індивідуальних генах, і делеційні, які за­ймають значні ділянки вірусного геному. Якщо крапкові мутації локалізуються в одному гені, такі мутан­ти називаються одноударними. До них належать температуро- чутливі мутанти, які втратили здатність розмножуватися за підвищеної температури (+38 — 41 °С), але репродукуються за звичайних умов культивуван­ня (+36 ... +37 °С). Крапкові мутації можуть локалізуватися у двох або кількох генах. У цьому разі кажуть про подвійні або множинні мутанти. Делеції, що характеризуються пошкодженням значних ділянок вірусного геному, можуть бути одиничними і подвійними, розміще­ними на протилежних кінцях молекули нуклеїнової кислоти. Деле- ційні мутанти представлені дефектними інтерферувальними час­тинками (ДІ-частинками). Вони утворюються у вірусних популяці­ях спонтанно, причому різні штами одного і того самого вірусу мо­жуть істотно відрізнятися за продукцією ДІ-частинок. Індуковані мутації. Не всі мутації, що виникли під дією мутагену, однаково стабільні. Більшості індукованих мутацій властива здатність повернення до дикого типу — реверсії. Можливі справжні реверсії, коли зворотна мутація відбувається в місці первинного пошкодження, і псевдоревер- сії, коли зворотна мутація відбувається в іншій ділянці дефектного гена (інтрагенна супресія) або в іншому гені (екстрагенна супресія). Мутації можуть мати різні наслідки. В одних випадках вони призводять до зміни фенотипу в нормальних умовах. Мутації є летальними, якщо внаслідок них пору­шується синтез або функція життєво важливого вірусоспецифічного білка, наприклад, вірусної полімерази. Іноді мутації є умовно лета­льними, оскільки вірусний білок зберігає свої функції в оптимальних для нього (пермісивних) умовах і втрачає цю здатність у нерозв’язних (непермісивних) умовах. Мутовані гени постійно включаються в генофонд вірусної популя­ції та збільшують її генетичну неоднорідність. Отже, внаслідок мута­цій окремі віріони набувають нових властивостей. Подальша доля таких вірусів-мутантів залежить від природного добору, який зберігає популяцію, найбільш пристосовану до конкретних умов існування.

3. Методи індикації вірусів у культурі клітин.Індикацію вірусу в культурі клітин здійснюють за такими ознаками: 1) наявність ознак деструкції клітинного моношару( цитопатогенний ефект ЦПЕ, цитопатогенна дія ЦПД); 2) здатність уражених клітин адсорбувати еритроцити крові (гемадсорбція); 3) утворення внутрішньоклітинних тілець-включень; 4) зміна кольору підтримувального середовища (кольорова проба). Крім того, вірус можна виявляти ц розпізнавати за допомогою електронної та імуноелектронної мікроскопії, різних серологічних реакцій (РІФ, РДП, ІФА, РЗГА та інших, а також за допомогою молекулярно-генетичних методів (гібридизація ДНК, ПЛР).ЦПД. Це будь-які зміни в культурі клітин під впливом вірусу, що репродукується в них. Розрізняють 3 форми ЦПД: 1) фрагментація клітин – клітини розпадаються на фрагменти, які відокремлюються від скла й накопичуються в культуральній рідині у вигляді клітинного детриту; 2) заокруглення клітин – клітини втрачають здатність прикріплюватися до скла і і з розпластаних на склі стають заокругленими, вільно плавають у культуральній рідині і гинуть; 3) симпластоутворення – клітинні оболонки розчиняються і цитоплазми сусідніх клітин зливаються. Реакція гемадсорбції полягає у тому, що уражені певними вірусами клітини здатні адсорбувати на своїй поверхні еритроцити крові певних видів тварин. Виявлення внутрішньоклітинних тілець-включень. Для виявлення моно шар клітин вирощують на покривних скельцях, вміщених у пробірки чи пеніцилінові флакони. Кольорова проба. Живильне середовище жовтіє (індикатор феноловий червоний) повільніше, ніж у контролі.

4. Принципи і схема постановки РІД. Принцип полягає в тому, що антитіла та відповідні антигени, дифундуючи в агаровому гелі, під час зустрічі утворюють комплекс антиген-антитіло. Проведення на предметних скельцях. На дві третини площі знежиреного предметного скельця наносять 2 мл розплавленого 1-1,5 %-го агару, приготовленого на фізіологічному розчині й консервованого мертіолятом натрію. Агар слід наносити швидко, спочатку по периметру скельця, потім заповнювати середину так, щоб агар лягав рівно, без пухирців і горбків, шаром завтовшки до 2 мм. Через 10-15 хв у застиглому агарі трубкою чи спеціальним трафаретом за відповідною схемою вирізають лунки діаметром 5 мм на відстані 3-4 мм одна від одної. Згідно зі схемою пастерівськими піпетками лунки заповнюють антигенами й сироватками, не переливаючи розчини через краї лунок. Кладуть скельце у вологу камеру – чашку Петрі з вологими ватяними тампонами на дні чи вологим папером під кришкою. Чашку ставлять у термостат і витримують 24-48 год при 37С. Результати враховують за наявністю смуг преципітації між гомологічними сироватками й антигенами. Проведення в бактеріологічних чашках. Вносять агар шаром завтовшки 3-5 мм, вирізають лунки більшого діаметра й на більшій відстані одна від одної. Час обліку збільшують до 5-7 діб.

Варіант №5