4 Препараты фиксированных окрашенных клеток и спор микроорганизмов

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии.

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов вклю­чает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фик­сацию и окраску [29].

4.1 Приготовление мазка и фиксация препарата

На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и пере­носят в нее петлей небольшое количество исследуемого материа­ла, как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1-2 см² возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько то­нок, чтобы высыхал после приготовления [30].

Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тон­кий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание мазка за­медленно, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегре­вая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются [31].

Фиксация мазка преследует несколько целей:

1) убить микро­организмы, т. е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними;

2) обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу;

3) сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки ок­рашиваются лучше, чем живые.

Самым распространенным спосо­бом фиксации является термическая обработка. Для этого препа­рат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пла­мени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следу­ет перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изме­нения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, на­пример их сморщивание.

Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими вещест­вами. Фиксирующую жидкость наливают на ма­зок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором [29].

Фиксирующие жидкости

1. 96°-ный этиловый спирт (время фиксации - 10-15 мин.)

2. Метиловый спирт, безводный (время фиксации - 3-5 мин.)

3. Смесь Никифорова (этиловый спирт и серный эфир в равных объемах, время фиксации - 5-10 мин.)

4. Спиртформол (40%-ный формалин - 5 мл, 96°-ный этиловый спирт - 95 мл; время фиксации - 5-15 мин.)

5. 1-2%-ный водный раствор осмиевой кислоты (фиксация в парах 3-5 мин.) Раствор осмиевой кислоты хранят в темном флаконе с притертой пробкой. При работе соблюдать осторожность, так как пары осмия могут повредить роговицу глаза.

6. 40%-ный формалин (фиксация в парах - несколько секунд).

7. Фиксатор Карнуа (96° спирт - 60 мл, хлороформ - 30 мл, ледяная уксусная кислоты - 10 мл; время фиксации - 15 мин.)

8. Жидкость Руге (40% формалин - 20 мл, ледяная уксусная кислота - 1 мл, вода дистиллированная - 1000 мл; время фиксации - 5 мин.) Рекомендуется для фиксации клеток, выращенных в жидких средах неопределенного состава.

9. Фосфорномолибденовая кислота, 5%-ный водный раствор (время фикса­ции - 5 мин.)

10. Жидкость Буэна (насыщенный водный раствор пикриновой кислоты  -  75 мл, 40 % формалин - 25 мл, ледяная уксусная кислота - 5 мл; время фиксации – 1-2 часа).

11. Глутаровый альдегид 2,5% (время фиксации – 10-15 мин.) [32].

Различают простые и дифференциальные способы окрашива­ния микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а определенных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксировать и окрашивать можно также и препараты «отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут хранить­ся длительное время [33].

Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов [34].