2. Физиологические и морфологические изменения, сопровождающие споруляцию и прорастание спор

Споры и другие покоящиеся формы формируются у бактерий в процессе клеточной дифференцировки, направленной на выживание в неблагоприятных условиях. Известны различные по структуре, составу и развитию типы таких дифференцированных клеток. Хорошо изучены эндоспоры у грамположительных бактерий (роды Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Thermoactinomyces). [19]

Бактерии способны выдерживать длительные периоды стресса, сохраняя жизнеспособность в течение многих лет в бедных питательными субстратами местообитаниях или в условиях бактерицидного действия химических или физических факторов. Споры бактерий выполняют предположительно две экологические функции. Во-первых, их образование служит способом приспособления к неблагоприятным условиям для переживания длительного периода стресса. Во-вторых, споры обеспечивают распространение бактерий в окружающей среде, позволяя виду колонизировать разнообразные местообитания. Они могут переноситься на большие расстояния потоками воздуха и дождевой воды, а также животными, благодаря чему спорообразующие бактерии в природе вездесущи. Почвенную бактерию Bacillus subtilis можно выделить из самых разнообразных экосистем, включая океанические осадки. Таким образом, экологическое значение эндоспор чрезвычайно велико.

Спорообразующие бактерии служат плодотворным объектом для изучения клеточной дифференцировки и развития многоклеточных структур, в том числе с применением методов молекулярной биологии [20].

2.1 Условия и стадии споруляции

Образование спор – не единственная стратегия выживания у бацилл в условиях дефицита источников углерода, фосфора, азота и других необходимых веществ. До инициации споруляции бактерии делают попытку осуществить множество адаптивных подходов, способствующих возобновлению вегетативного роста (синтез внеклеточных ферментов деградации и антибиотиков, увеличение подвижности, хемотаксис) [21].

Недостаток питательных соединений в среде включает у бацилл несколько клеточных ответов – реакций, цель которых либо предотвратить голодание, либо приготовить клетку к длительному периоду, в течение которого питательные вещества будут недоступны. Известно, что эти ответы индуцируются нехваткой углерода, азота и фосфора, непосредственно вовлеченных в процессы метаболизма. Один из ранних ответов клетки на уменьшение концентрации питательных веществ заключается в синтезе жгутиков, которые превращают неспособные к передвижению, прикрепленные друг к другу клетки логарифмической фазы в высокоподвижные, не связанные одна с другой клетки ранней стационарной фазы. Увеличение подвижности позволяет клеткам посредством хемотаксиса искать питательные вещества и их источники [1].

В дополнение к увеличению подвижности отсутствие питательных веществ дерепрессирует ряд генов, которые кодируют внутриклеточные и внеклеточные ферменты. Внутриклеточными ферментами в данном случае являются ферменты цикла трикарбоновых кислот и другие ферменты утилизации углерода. Когда бациллы растут в присутствии глюкозы, в среде накапливаются такие органические кислоты, как пировиноградная кислота и уксусная, что уменьшает ее рН до 5-6. После того, как глюкоза кончается и дерепрессируются ферменты цикла трикарбоновых кислот, в качестве источника углерода начинают использоваться органические кислоты и рН среды увеличивается примерно до 7. Таким образом, смена ферментов внутриклеточного метаболизма позволяет клетке использовать новые источники углерода.

Кроме синтеза нового набора внутриклеточных ферментов, по мере истощения источников питания дерепрессируются гены внеклеточных ферментов. К этим секретируемым ферментам относятся протеазы, нуклеазы, амилазы, фосфатазы и другие гидролитические ферменты. Внеклеточные ферменты находят и атакуют в окружающей бактерию среде подходящие биополимеры и субстраты и таким образом снабжают клетку питательными веществами [22].

Если клетка сумела приблизиться к новому источнику питательных веществ или ее внеклеточные ферменты способны гидролизовать достаточное количество питательных биополимеров в микроокружении, она продолжает расти. Однако, если все это не может обеспечить клетку требуемыми питательными веществами, она инициирует другую последовательность событий, которая приводит к образованию покоящейся споры. При подходящих условиях споры способны оставаться бездействующими в течение многих лет. Однако те же самые споры могут прорастать за несколько минут, если их суспендировать в среде, богатой питательными веществами.

Сам процесс споруляции разделяется на семь стадий, различия между которыми основаны на цитологических изменениях, происходящих в процессе образования споры. Стадия 0, являющаяся подготовительной стадией споруляции, наблюдается в конце логарифмической фазы роста. В лабораторных условиях процесс споруляции обычно занимает около 6-8 ч, и, таким образом, порядковый номер стадии развития и время, выраженное в часах, почти совпадают.

На стадии 0 никаких морфологически различимых споруляционных структур нет, и клетки имеют вид, характерный для вегетативной стадии. В настоящее время на стадии I не идентифицированы какие-либо морфологические изменения, характерные для процесса споруляции; таким образом, можно считать, что развивающиеся клетки переходят от стадии 0 к стадии II.

Стадия II – это первая стадия споруляции, распознаваемая морфологически. Она характеризуется появлением проспоровой перегородки, которая асимметрично делит клетку на маленькую проспору и большую материнскую клетку. Это критический шаг, так как образование асимметрично расположенной мембраны является ключевым этапом споруляции.

В течение стадии III материнская клетка поглощает проспору. Проспора, которая теперь находится в цитоплазме материнской клетки, имеет на периферии двойную мембранную структуру, и молекулы, перемещающиеся из цитоплазмы материнской клетки в цитоплазму проспоры, должны пройти через эту двойную мембрану по следующему пути: цитоплазма материнской клетки → внешняя мембрана проспоры →пространство между мембранами →внутренняя мембрана проспоры → цитоплазма проспоры.

После поглощения проспоры процесс споруляции становится необратимым, и обогащение питательной среды уже не способно его остановить.

На стадии V начинается образование кортекса между внетренней и внешней мембранами проспоры. В это время спора начинает сильно преломлять свет, что хорошо заметно при микроскопировании. За стадией IV, в течение стадии V, происходит конденсация белков внутренней споровой оболочки на поверхности внешней мембраны проспоры. Внутренняя оболочка споры представляет собой сложно организованную многослойную структуру.

Внешняя оболочка споры конденсируется на поверхности внутренней оболочки в течение стадии VI. Итак, споровая оболочка – это сложная структура, состоящая из белкового внешнего слоя (внешняя оболочка споры) и пластинчатого внутреннего слоя (внутренняя оболочка споры). По мере развития споровой оболочки спора становится все более устойчивой к нагреванию и химическим реагентам. Созревание споры происходит на стадии VI, и за ним, на стадии VII, следует освобождение зрелой споры от материнской клетки. Образуется специфичное для спор вещество - дипиколиновая (пиридин-2,6-дикарбоновая) кислота. В вегетативных клетках эта кислота не встречается. В ходе синтеза дипиколиновой кислоты происходит поглощение ионов кальция; в зрелых спорах эта кислота находится, по-видимому, в виде хелата с кальцием и может составлять 10-15% сухого вещества спор. Дипиколиновая кис­лота локализована в протопласте споры и имеется только в терморези­стентных эндоспорах [23].