2 Разработка люминесцентного метода выявления эндоспор

2.1 Изучение диагностической эффективности известных методов окраски эндоспор

На первом этапе исследований нам необходимо было получить количественную информацию о диагностической эффективности существующих в микробиологической практике методов окраски бактериальных эндоспор. С этой целью из каждой тест-культуры готовили мазки в строгом соответствии с известной методикой окраски. Полученные препараты исследовали под микроскопом. Результаты анализа представлены в таблице 3 и на рисунке 7.

Таблица 3. Содержание спор в мазках, окрашенных различными способами. , %.

Вид бактерий	Количество спор, выявленное при микроскопии мазков, окрашенных по методу
	Циля-Нильсена	Ожешко	Шеффера-Фултона
Bacillus cereus	73±0,3	49±0,2	68±0,2
Bacillus licheniformis	33±0,1	18±0,1	30±0,1
Bacillus thuringiensis	83±0,1	54±0,2	80±0,3

Рисунок 7. Доля окрашенных спор в препаратах, окрашенных различными способами. 1 – окраска по Цилю-Нильсену; 2 – окраска по Ожешко; 3 – окраска по Шефферу-Фултону.

Данные методы выявления эндоспор имеют существенные различия в составе реактивов, повышающих проницаемость спор, красителей и обесцвечивающих растворов. Так, в методе Циля-Нильсена повышает проницаемость спор нагревание в пламени спиртовки, в методе Ожешко – нагревание 0,5% раствора HCl, методе Шеффера-Фултона – водные пары. Также различаются красители, если в методах Циля-Нильсена и Ожешко для окраски спор используется карболовый фуксин Циля, а для докраски вегетативных клеток – метиленовая синька, то в методе Шеффера-Фултона используются соответственно малахитовый зеленый и фуксин Пфейфера. В методах Циля-Нильсена и Ожешко для дифференцировки применяют 5%-ный раствор серной кислоты, в методе Шеффера-Фултона этот прием не используется, а лишь обильно промывают мазок водой. В целом, данные методы показали примерно одинаковый процент выявления эндоспор в мазках. Несмотря на то, что в методах Циля-Нильсена и Шеффера-Фултона используются различные красители, реактивы, повышающие проницаемость спор, и сами методики существенно отличаются, их результат примерно одинаков. Ниже процент обнаруженных спор у метода Ожешко. Это связано, скорее всего, с тем, что 0,5%-ная соляная кислота наносится на нефиксированный препарат, нагревается, а затем обильно промывается, при этом часть бактерий и спор может быть смыта.

Таким образом, все способы окраски спор основаны на одном принципе. Сначала споры обрабатывают разными веществами – хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода в целях нарушения проницаемости споровых облочек, затем окрашивают клетку со спорой при нагревании, наконец, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастными красителем.

Однако, область применения данных методов выявления спор ограничена лишь возможностью исследования высококонцентрированных бактериальных суспензий. Применительно к низко концентрированным материалам данные методы в силу особенностей световой микроскопии по методу светлого поля малоприменимы, так как глаза человека плохо замечают единичные окрашенные объекты на светлом фоне. В этом отношении более предпочтительно использовать люминесцентную микроскопию, которая в большей степени соответствует особенностям органа зрения замечать единичные светящиеся объекты на темном фоне. В силу отмеченных обстоятельств представилось целесообразным испытать возможности люминесцентной микроскопии для выявления эндоспор.