4.4 Прижизненное выявление эндоспор при помощи фазово-контрастной микроскопии

Метод фазово-контрастной микроскопии, предложенный голландским физиком Цернике для наблюдения за прозрачными объектами, основан на преобразовании фазовых изменений, претерпеваемых световой волной при прохождении через микрообъект, в видимые амплитудные с помощью специального оптического устройства.

Микроскопия с фазово-контрастным устройством основана на том, что с его помощью различия в фазе световых лучей, возникающие при прохождении их через прозрачные объекты, превращаются в амплитудные, в результате чего объекты становятся контрастными [37].

Глаз человека выявляет различия в длине волны света (цвет) и ее амплитуде (интенсивность, яркость), но не в состоянии заметить смещение фазы. Неокрашенные клетки микроорганизмов хорошо видны в проходящем свете обычного светопольного микроскопа только в том случае, когда значительная часть энергии света, прошедшего через них поглощается. При этом выходящая из объекта (клетки) световая волна имеет меньшую амплитуду, т.е. яркость, и этот объект воспринимается глазом наблюдателя как более темный, контрастный по сравнению с окружающей средой. Однако многие микроорганизмы, размеры которых лежат в пределах разрешающей способности микроскопа, мало отличаются по прозрачности (плотности) от окружающей среды. Амплитуда световой волны, проходящей через клетки таких микроорганизмов, почти не меняется, поэтому объекты плохо различимы или даже невидимы в обычный светопольный микроскоп. Поле зрения кажется наблюдателю почти однородным.

Объект можно сделать более контрастным, либо почти до предела закрывая диафрагму конденсора, либо окрашивая клетки, либо применяя фазово-контрастное устройство. Первое нежелательно, так как снижает апертуру конденсора и тем самым заметно уменьшает разрешающую способность микроскопа. Окрашивание препарата дает хорошие результаты, но в большинстве случаев оно осуществляется после фиксации микроорганизмов, что не всегда желательно. Основная ценность метода фазового контраста состоит в том, что он дает возможность наблюдать живые объекты, не прибегая к их фиксации и окрашиванию [34].

Однако широкому распространению данного метода препятствует близость показателей светопреломления бактериальных эндоспор и включений поли-β-оксимасляной кислоты, что в некоторых случаях может привести к ошибкам диагностики.

4.5 Методы люминесцентной окраски эндоспор

Сущность люминесценции в самом общем виде заключается в том, что молекулы некоторых веществ, поглощая кванты энергии (света, радиоактивного излучения и др.), переходят в неустойчивое возбужденное состояние. Через некоторое время эти молекулы переходят в устойчивое исходное состояние, выделяя часть поглощенной энергии в виде квантов света. В зависимости от вида энергии, возбуждающей люминесценцию, различают фотолюминесценцию, радиолюминесценцию и т.д. [38]

Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 300-400 нм или сине-фиолетовыми лучами с длиной волны 400-460 нм [34].

Явление фотолюминесценции подразделяется также в зависимости от длительности пребывания молекул в возбужденном состоянии на флюоресценцию, при которой высвечивание происходит не позже чем через 10^-9 – 10^-7 с, и фосфоресценцию, при которой свечение продолжается в течение значительно более длительного промежутка времени. Люминесцентная микроскопия основана на явлении фотофлюоресценции, которое обычно в литературе называют флюоресценции или люминесценцией [38].

Ряд веществ биологического происхождения – хлорофилл, витамин В2, алкалоиды, каротиноиды, порфирины, кофакторы, некоторые антибиотики и другие соединения обладают собственной люминесценцией. В зависимости от содержания таких веществ в клетке группе микроорганизмов, например зеленым водорослям, некоторым дрожжам и бактериям (метаногенам), свойственна первичная люминесценция [34]. Однако, подавляющее большинство микроорганизмов при их просмотре под люминесцентным микроскопом обнаруживают весьма слабую собственную серо-голубоватую флюоресценцию. Попытки использования ультрафиолетового света для целей дифференциации различных бактериальных культур по их собственной флюоресценции не дали пока существенных результатов. Это связано с тем обстоятельством, что собственная флюоресценция микроорганизмов недостаточно специфична, в значительной степени подвержена влиянию внешних условий (рН и состав питательной среды) и имеет малую интенсивность.

Гораздо большее значение в практике люминесцентной микроскопии приобрела так называемая вторичная, или наведенная, флюоресценция микроорганизмов. Вторичную флюоресценцию микроорганизмов можно получить при обработке последних растворами флюоресцирующих красителей. Практически любой микроскопический препарат, мало или совсем не флюоресцирующий, можно превратить в ярко флюоресцирующий путем окраски флюорохромами. Окраска объектов флюорохромами получила название флюорохромирования. Методика применения флюорохромов в бактериологической практике была разработана в основном Хайтингером с сотрудниками и Хагеманном [39].

Флюорохромы, применяемые в бактериологической практике, относятся к различным группам органических соединений. Флюорохромы применяются для окраски в виде растворов. Флюоресцирующие красители фотореактивны и могут изменяться (выцветать) под действием прямого яркого света. Это явление часто связано с фотохимической реакцией, сопровождаемой окислением. Поэтому растворы флюорохромов необходимо хранить во флаконах из темного стекла и избегать действия на них света.

Для выявления микроорганизмов с помощью методики флюорохромирования могут быть применены разнообразные способы приготовления препаратов и их окраски соответствующими флюорохромами в зависимости от задач исследования.

Дифференциальные способы флюорохромирования фиксированных микробов имеют в своей основе особенности физико-химического строения микробов и позволяют проводить разграничения между морфологически близкими видами.

Для выявления бактериальных спор используется метод флюорохромирования по Хагеманну.

1. Фиксация мазков на пламени.

2. Флюорохромирование препаратов водным раствором (1:400) бриллиантсульфофлавина, к которому добавлено 0,5% жидкой карболовой кислоты. Окрашивание продолжается в течение 1-2 минут при нагревании.

3. Тщательное промывание в воде.

4. Дополнительная окраска в течение 40 секунд в водном растворе корифосфина (1:1000).

5. Промывание водой и высушивание на воздухе.

При такой окраске препарата споры флюоресцируют зелено-желтым светом, а все другие неспорообразующие бактерии и вегетативные формы спороносных бактерий флюоресцируют красным светом.

Для окраски спор вполне пригодны методы флюорохромирования, предложенные для окраски кислотоустойчивых бактерий [39].