19. Биологический агент.

Биологический агент является активным началом в биологических процессах и одним из наиболее важных из элементов. Номенклатура биологических агентов бурно расширяется, но до настоящего времени важнейшее место занимает традиционный объект - микробная клетка. Микробные клетки могут быть выделены из природных источников и далее существенно модифицированы и улучшены с помощью традиционных (селекции, отбора) и новейших (клеточной и генетической инженерии) методов. При выборе биологического агента и постановке его на производство прежде всего следует соблюдать принцип технологичности штаммов.  Это значит, что микробная клетка, популяция или сообщество особей должны сохранять свои основные физиолого-биохимические свойства в процессе длительного ведения ферментации. Промышленные продуценты также должны обладать устойчивостью к мутационным воздействиям, фагам, заражению посторонней микрофлорой, характеризоваться безвредностью для людей и окружающей среды, не иметь при выращивании побочных токсичных продуктов обмена и отходов, иметь высокие выходы продукта и приемлемые технико-экономические показатели.  В настоящее время многие промышленные микробные технологии базируются на использовании гетеротрофных организмов, а в будущем решающее место среди продуцентов займут автотрофные микроорганизмы, не нуждающиеся для роста в дефицитных органических средах, а также экстремофилы - организмы, развивающиеся в экстремальных условиях (термофильные, алкало- и ацидофильные).  В последние годы расширяется применение смешанных микробных культур и их природных ассоциаций. В такого рода смешанных культурах между микроорганизмами устанавливаются определенные взаимоотношения, основанные на экологических принципах взаимодействия в смешанных популяциях.  Возможны различные типы такого взаимодействия:  • нейтрализм - практическое отсутствие взаимодействия между видами. Пример нейтрализма - рост штаммов Streptococcus и Lactobacillus (входящих в состав закваски при производстве йогурта). При скорости разведения 0,4 час-1 оба вида микроорганизмов растут с одинаковой скоростью, такой же, как в чистых культурах;  • мутуализм - оба штамма быстрее растут в смешанной культуре, чем в соответствующих чистых культурах.  Пример: совместное культивирование штамма Lactobacillus, нуждающегося в фенилаланине, и штамма Streptococcus, нуждающегося в фолиевой кислоте.  На среде, не содержащей ни одного из этих компонентов, чистые культуры обоих штаммов практически не растут. Смешанная культура растет на этой среде хорошо. В данном случае мутуализм представляет собой взаимный обмен ростовыми факторами. Резко выраженный мутуализм, когда один микроорганизм совершенно не может существовать без другого называют симбиозом.  Пример: в свое время была описана «бактерия» Metanobacillus omelianskii, которая при ближайшем рассмотрении оказалась смесью двух видов. Один из них окисляет этанол до ацетата с образованием водорода, но его рост подавляется продуцируемым им же водородом. Второй вид не способен расти на этаноле, но утилизирует водород, превращая его в метан.  Если один вид продуцирует вещества, ускоряющие рост другого вида, говорят, что во взаимоотношениях между этими видами имеет место комменсализм. Противоположен комменсализму аменсализм, когда один вид продуцирует вещество, подавляющее рост второго вида.  По сравнению с монокультурами микробные ассоциации способны потреблять сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализуют сложные органические соединения, имея повышенную способность к биотрансформации, имеют повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсических веществ, а также повышенную продуктивность и возможность обмена генетической информацией между отдельными видами сообщества. Основные области применения смешанных культур - производство пищевых продуктов, охрана окружающей среды, биодеградация и усвоение сложных субстратов.  Особая группа биологических агентов в биотехнологии - ферменты, катализаторы биологического происхождения. Ферменты находят все большее применение в медицине, пищевой промышленности и т. д.  До 60-х гг. это направление сдерживалось трудностями их получения, неустойчивостью, высокой стоимостью. Как отдельную отрасль в создании и использовании новых биологических агентов следует выделить иммобилизованные ферменты: преимущество - стабильность и повышенная активность, удержание в объеме реактора, возможность полного быстрого отделения продуктов ферментации с многократным использованием биологического агента.  К нетрадиционным биологическим агентам на данном этапе развития биотехнологии относят растительные и животные ткани, в том числе гибридомы, трансплантанты. Большое внимание в настоящее время уделяется получению новейших биологических агентов - трансгенных клеток микроорганизмов, растений, животных - генно-инженерными методами.  Развиты также новые методы, позволяющие получать искусственные клетки с использованием различных синтетических и биологических материалов (изотопы, антитела и др.) Разрабатываются подходы к конструированию ферментов с заданными свойствами, имеющих повышенную реакционную активность истабильность. 

20. Очистка и стерилизация воздуха в биотехнологическом процессе.Все методы очистки воздуха можно разделить на 2 группы: 1-ая предполагающая бактерицидную обработку воздуха. Во 2-ой основой является отделение микроорганизмов от воздуха. Первая группа связана в использовании дезинфектантов (окись этилена). Чаще используют бактерицидную лампу. Эта группа методов предназначена для стерилизации в основном в лаборатории.Вторая группа получила широкое распространение в производственной практике. Основанная на фильтровании воздушного потока через волокнистые и пористые материалы. Эффективность фильтрации определяется коэффициентом проскока: Эф=1-Кпр

Кпр=N/Nо*100%, где Кпр- коэффициент проскока

N-количество микроорганизмов поступающих на фильтр

Nо-количество микроорганизмов прошедших через фильтр.

Описание схемы стерилизации воздуха.

Атмосферный воздух предварительно очищается в масляном фильтре.Затем нагнетается турбокомпрессором до давления 0,2КПа. Далее воздух поступает в теплообменник и фильтр. Фильтры тонкой очистки называются индивидуальными и устанавливаются перед ферментатором.

21. Классификация фильтрующих материалов.Фильтрующий материал классифицируют по обеспечению заданной степени очистки и стерилизации воздуха на фильтры грубой и тонкой очистки. Для грубой очистки используют синтетические и минеральные волокна: синтепон, поролон, пенополиуретан, стекловата, стекловолокно,полиэфирное или базальтовое волокно. Для тонкой очистки современная технология представлена системами высокоэффективной задержки частиц ( НЕРА). Фильтры НЕРА различаются в зависимости от способности задерживать частицы определенного размера. НЕРА от Н10 до Н14 , чем выше тем больше эффективная очистка. 85% для Н10 и 99,9% для Н14. По механическому составу фильтрации материал классифицируется на волокнистые, зернистые, мембранные. Недостаток волокнистых материалов в том, что у них низкая степень использования рабочего объема фильтра

рисунок 1

22. Стерилизация питательных сред.Для приготовления производственной питательной среды предварительно растворяют сахара и соли, тщательно суспендируют такие нерастворимые компоненты, как соевая мука и мел. Крахмалосодержащее сырье предварительно клейстеризуют. Для ускорения эти процессы проводят в небольших аппаратах с мешалками (реакторах), а затем растворы смешивают в смесителе-реакторе с плоским дном, снабженным барботажным устройством для ввода пара. Концентрат среды, составляющий около одной трети необходимого объема, для окончательного растворения и суспендирования нагревают острым паром до 70-80 ºС. При этой температуре не происходит разложения термолабильных компонентов среды. Приготовление более концентрированных сред дает возможность использования смесителей меньшей вместимости.Необходимое условие успешной стерилизации питательной среды – тщательная гомогенизация ее твердых компонентов. При температуре стерилизации крупные частицы медленно прогреваются, и в них может сохраняться постоянная микрофлора, способная инфицировать культуральную жидкость.Для приготовления питательных сред в биотехнологическом производстве используют мелассу (побочный продукт сахарных заводов), ацетоно-бутиловую барду (отходы производства ацетона и бутанола), сыворотки (побочный продукт молочной промышленности), гидролизаты древесины, сульфитный щелок (отходы целлюлозно-бумажной промышленности). Ацетоно-бутиловая барда содержит около 1% углеводов, используется для получения витамина В₁₂ микробиологическим путем.Щепа, опилки, сельскохозяйственные отходы, малоразложившийся торф и их гидролизаты используются в производстве кормовых дрожжей, этанола. Они содержат 2,5-8,0% моносахаридов (после гидролиза), кукурузная мука – 67-70%. Уксусная кислота применяется для приготовления питательных сред в производстве лизина. Метиловый спирт получают каталитическим синтезом из оксидов углерода и водорода. Это источник углеродсодержащего сырья для производства микробного, кормового и пищевого белка.Питательная среда перед подачей в ферментер должна быть обеззаражена. На этом этапе подготовки субстрата необходимо решить две задачи: полностью уничтожить всю контаминантную микрофлору, которая содержится в необходимом для культивирования объеме жидкости, и сохранить биологическую полноценность питательной среды.Существуют следующие методы стерилизации оборудования, питательных сред и воздуха: термический, химический, фильтрационный, радиационный. Термический метод чаще всего применяется для стерилизации оборудования и питательных сред и может осуществляться как нагревание объекта до того, пока не погибнет вся микропопуляция.Жидкую питательную среду после загрузки в ферментер нагревают до определенной температуры путем подачи пара во внутренний объем ферментера. Этим приемом достигается стерилизация труб и арматуры.Тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе питательной среды. Некоторые из них сводятся к разложению нестойких к нагреванию соединений, что приводит к потере необходимых для питания микроорганизма веществ. В процессе стерилизации может происходить взаимодействие различных компонентов среды и образование продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов. большинство изменений химических ингредиентов среды возникает при температурах выше, чем температура стерилизации.эффективная стерилизация в сочетании с минимальными изменениями среды может быть достигнута путем воздействия более высокой температуры, а также быстрого нагревания и охлаждения.Если стерилизацию углеводов проводить отдельно, а затем асептически добавлять к остальной заранее простерилизованной питательной среде, то можно предотвратить реакции между углеводами и другими составными компонентами среды. Те компоненты, которые в высшей степени чувствительны к воздействию тепла, также могут быть простерилизованы раздельно. При этом для стерилизации может применяться ионизирующее облучение или фильтрация через специальные мембранные фильтры.Для обеспечения контроля стерилизации используют споры тест микроорганизмов Bacillus stearothermophilus штамма 1518. Если после проведения стерилизации из ампулы с тест-культурой высев дает отрицательный результат, считают, что произошло уничтожение всех микроорганизмов, контаминировавших среду.Решая задачу по гарантированной стерильности питательной среды, следует помнить, что режим обеззараживания не должен снижать ее биологическую полноценность. Если в состав стерилизуемой фазы входят термолабильные компоненты, то следует стремиться к повышенной температуре (более 140ºС), а также к сокращению времени обработки. Лабильность компонентов может быть изменена за счет сдвига pH стерилизуемой среды. Например, для глюкозы оптимальными являются pH=3,0, а для сахарозы – pH=8,0.Термический способ стерилизации применяется наиболее часто в микробиологической промышленности. Однако для стерилизации твердых питательных сред применяют токи высокой частоты. Стерилизация осуществляется в течение нескольких минут, при этом физико-химические свойства компонентов среды не изменяются.Химический способ стерилизации – это применение дезинфицирующих агентов – β-пропионатов, окись этилена, окись пропилена. Основной проблемой в этом случае оказывается необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели посторонней микрофлоры. Поэтому химические антисептики должны легко разлагаться при изменении условий после завершения стерилизации. Выбор таких соединений невелик, и пока их нельзя считать легко доступными. К числу лучших из них можно отнести пропиолактон, обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в нетоксичную молочную кислоту. Химическая стерилизация питательных сред не нашла промышленного применения, однако используют ее в лабораторных и опытных установках.Фильтрационный метод стерилизации применяют для воздуха и газов, подводимых к реакторам. Из фильтров различных типов наиболее перспективны мембранные фильтры из тефлона.Метод основан на способности полупроницаемых мембран (типа микрофильтрационных) пропускать жидкую фазу и задерживать клетки микроорганизмов.Метод стерилизующей фильтрации является идеальным средством стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых сред. Стерилизация осуществляется при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Мембранная стерилизация имеет перспективы в развитии микробной биотехнологии. Основная трудность – наличие термостойких мембран, способных выносить многократную термическую стерилизацию их в процессе эксплуатации. Можно утверждать, что по мере создания совершенных конструкций мембранных аппаратов для стерилизации, рассчитанных на длительную эксплуатацию, данный метод будет широко применяться в крупнотоннажных производствах.Подготовленное и соответствующим образом поданное в техногенную экологическую нишу сырье должно быть использовано биообъектом в процессе культивирования. Этап культивирования слагается из получения посевного материала (инокулята) и из стадии биосинтеза (биотрансформации), когда в максимальной степени используются возможности биообъекта для наработки целевых продуктов.