Розділ 8. Фітобіотехнологія

Фітобіотехнологія – це сукупність технічних прийомів для модифікації, покращення, створення та розмноження рослинних організмів, одержання з них корисних речовин. Основою фітобіотехнології є метод культури тканин – вирощування ізольованих клітин, їхніх структур, тканин і органів на штучних живильних середовищах у стерильних умовах. В останні роки значно зріс інтерес до використання методу культури рослинних тканин. Це пояснюється тим, що новітні досягнення сучасної фізіології рослин, вірусології, цитології, генетики, селекції, молекулярної біології значною мірою зумовлені розвитком методів культивування

in vitro ізольованих клітин, тканин і органів рослин. Фундаментальні дослідження клітин і тканин in vitro є основою, яка дає змогу об’єднати різні рівні досліджень, починаючи з молекулярного та закінчуючи популяційним, що надзвичайно важливо для вивчення різних проблем рослинного організму в цілому. Цей метод біологічного моделювання дає змогу вивчати елементи кореляційних зв’язків і ефектів, характерних для всього рослинного організму. Одним із основних принципів методу культури тканин є ступінь відтворення in vitro умов, близьких або ідентичних до

тих, в яких клітина міститься на материнській рослині in vivo.

Відомо, що клітини різних тканин, органів, організмів функціонують in vivo в специфічних метаболічних умовах. Це є науковою основою для розробки різних за складом живильних середовищ. Існує більше ста живильних середовищ для культивування in vitro рослинних клітин, тканин і органів.

На основі методу культури рослинних клітин і тканин створені різні технології, серед яких:

• клональне мікророзмноження та оздоровлення рослин;

• одержання промисловим способом біологічно активних речо-

вин рослинного походження;

• одержання соматичних гібридів рослин;

• створення генетично модифікованих рослин методами клітинної та генної інженерії.

Метод культури рослинних тканин останнім часом все ширше застосовують для вивчення: дії на рослини різних екстремаль них факторів, взаємодії рослинної клітини з патогенними організмами, гетерозису, несумісності генетичної інформації двох геномів, стерильності гібридів у разі віддаленого схрещування, трансплантації клітин, їхніх частин і навіть органів.

Усі проблеми, для вирішення яких використовують метод культури тканин, поділяють на три групи, які вирішуються на основі:

• епігенетичної зміни генетичної інформації, її поступової реалізації під впливом умов вирощування in vitro;

• зміни генетичної інформації шляхом мутагенезу;

• перенесення й інтеграції генетичної інформації.

Робота № 72. Методи стерилізації посуду, інструментів і допоміжних матеріалів

Основні відомості. Чистота і стерильність – головні вимоги роботи в біотехнологічній лабораторії. Стерилізація приміщення, ламінарів, інстру-

ментів, посуду, живильних середовищ, рослинного матеріалу на всіх етапах роботи є основою спіху і в багатьох випадках набагато важливіші, ніж спеціальне обладнання.

Мета роботи. Оволодіти основними способами стерилізації посуду, інструментів і допоміжних матеріалів.

Матеріали, реактиви, обладнання. Колби, пробірки, чашки Петрі, мірні піпетки, скальпелі, пінцети, 96° спирт, папір для загортання посуду, целофан, фільтрувальний папір, металевий або скляний пенал для інструментів, спиртівка, термостат, автоклав, ламінар-бокс.

Хід роботи.

1. Стерилізація посуду.

Стерилізація сухим жаром. Лабораторний посуд (колби, пробірки, чашки Петрі тощо ) перед наповненням живильним середовищем попередньо стерилізують сухим жаром у сушильній шафі. Піпетки зручно стерилізувати в скляних пеналах, на дно яких необхідно покласти вату, щоб запобігти обламуванню носиків піпеток.

Тривалість стерилізації: за 150°С – 2,5 год, за 160°С – 2 год, за 170°С – 1 год.

Примітка. Слід пам’ятати, що до цього часу стерилізації необхідно додавати час, який потрібний для нагрівання завантажених у шафу предметів до заданої температури.

Стерилізація сухим паром. Посуд загорнутий у папір або зватними тампонами стерилізують автоклавуванням. За автоклавування піпеток верхню частину закривають ватним тампоном (приблизно на 2 см) і кожну окремо загортають у папір.

Залежно від заповнення автоклава автоклавування триває 30...40 хв. за тиску 2 атм і температури 133 °С.

Примітка. Камера автоклава заповнюється не більш як на 2/3 об’єму.

2. Стерилізація інструментів. Стерилізація сухим жаром. Інструменти попередньо стерилізують сухим жаром у сушильній шафі так само як і посуд.

Стерилізація полум’ям. У боксі безпосередньо перед роботою інструменти занурюють у порцеляновий стакан із 96°спиртом і стерилізують обпалюванням у полум’ї спиртівки. Стерильний інструмент використовують лише для одноразової маніпуляції. Перед повторним використанням його знову необхідно простерилізувати спиртом і обпалити.

3. Стерилізація допоміжних матеріалів.

Вату, корки, марлю, папір, целофан, фольгу стерилізують автоклавуванням.

4. Перед початком операцій ламінарний бокс необхідно підготувати до роботи. Для цього упродовж 30 хв. його стерилізують ультрафіолетом, після чого робочу поверхню протирають 70...96°спиртом.

Контрольні питання

1. Що таке біотехнологія?

2. Чому біотехнологію поділяють на класичну і сучасну?

3. У чому полягає суть методу культури in vitro клітин, тканин та органів рослин?

4. Як на практиці застосовують культуру тканин?

5. Який посуд використовують для роботи з культурою ізольованих клітин, тканин та органів рослин?

6. Як здійснюється стерилізація посуду та допоміжних матеріалів?

7.Назвіть методи стерилізації інструментів.

Робота № 31. Стерилізація насіння та вирощування асептичних рослин

Основні відомості. Основна умова вирощування in vitro рослинних клітин, тканин і органів - це стерильність. У зв’язку з тим, що поверхневі тканини органів рослин інфіковані епіфітними бактеріями, грибами та їхніми спорами, першим кроком для отримання ізольованих клітин, тканин і органів рослин є стерилізація вихідного матеріалу.

Для стерилізації рослинного матеріалу використовують широкий набір різних стерилізуючих речовин. Найпоширенішими є розчини, що містять активний хлор (гіпохлорит кальцію та натрію, хлорамін, “Білизна”), ртутні препарати (сулема, діацид) і окисники (перекис водню, перманганат калію). Іноді використовують препарати азотнокислого срібла – 0,5.2,0 % AgNO3.

Правильний вибір стерилізуючої речовини полягає у тому, щоб нейтралізувати епіфітну мікрофлору і не пошкодити тканини рослин. Крім цього, речовина не повинна глибоко проникати у тканину і має легко вимиватися. Залежно від ступеня забруднення насіння ділять на три групи:

• із незначним зараженням поверхні мікроорганізмами (насіння пшениці, сорго, капусти);

• із зараженням лише зовнішньої поверхні насіння (латук, шпинат, редис, томат, кукурудза, морква);

• з наявністю мікроорганізмів на поверхні і в середині насіння (рис, соняшник, соя, сосна).

Режим обробки насіннєвого матеріалу обирають залежно від того, до якої групи належить насіння. Але стерилізуючу речовину, її концентрацію, а також час стерилізації необхідно визначати для кожного виду та сорту дослідним шляхом.

Мета роботи. Отримати стерильне насіння та виростити з нього асептичні рослини.

Матеріали, реактиви, обладнання. Мильний розчин, 70 %-й розчин спирту, склянки зі стерильною водою, концентрований розчин “Білизни”, склянки для стерилізуючих розчинів, мірний циліндр, насіння сої, пробірки з безгормональним середовищем МС для рослин сої, чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, марля, пінцети, скальпелі, спиртівка, спирт для стерилізації інструментів, ламінар-бокс.

Хід роботи.

1. Приготувати розчин “Білизни” – одна частина препарату і три частини води (1:3).

Примітка. Розчин використовують одноразово відразу після приготування.

2. Промити насінини сої мильним розчином.

3. У марлеві мішечки покласти по 10 насінин.

4. Промиті насінини у боксі на 1 хв. помістити у склянку з 70 %-м етанолом.

5. Стерильним пінцетом перенести мішечки з насінинами у склянки зі стерилізуючим розчином і витримати 15…18 хв.

Примітка. Об’єм насіння має займати 1/4 об’єму стерилізуючого розчину. Мішечки потрібно перевертати кожні 2 хв., аби розчин гарно змочував насіння.

6. Простерилізоване насіння промити у стерильній дистильованій воді. Стерильним пінцетом перенести мішечки із склянки зі стерилізуючим розчином у склянку зі стерильною дистильованою водою. Витримати 10 хв. Промивання повторити тричі, використовуючи нову порцію води.

7. Мішечки з промитим насінням стерильним пінцетом перенести у стерильну чашку Петрі з проавтоклавованими паперовими фільтрами, аби забрати надлишок води.

8. Стерильним пінцетом перенести один із мішечків до іншої чашки Петрі, розгорнути його двома пінцетами і згребти насіння у цю саму чашку.

9. Стерильним пінцетом перенести насіння на безгормональне живильне середовище у пробірки. Відкрити пробірку, обпалити горло пробірки у полум’ї спиртівки, стерильним пінцетом помістити насінину на середовище, знову обпалити горло пробірки і корок в полум’ї спиртівки, після чого закрити пробірку корком.

Підписати пробірку, зазначивши середовище, вид або сорт рослини і дату посадки.

10. Пробірки з насінням помістити у термостат за температури 25 ±1°С.

11. За 4.6 діб перевірити чистоту посіву та схожість насіння. Визначити відсоток асептичного насіння. Результати записати у таблицю

12. Після проростання насіння пробірки перенести у термостат з освітленням 400 лк і температурою 25±1°С.

Таблиця . Визначення оптимальних умов стерилізації насіння

Номер досліду	Концентрація розчину “Білизни”	Тривалість стерилізації, хв	Загальна кількість насіння	Кількість інфікованого насіння за 7 діб		Схожість насіння		Ефективність стерилізації, %
				штук	%	штук	%
1	1:3	15
2	1:3	17
3	1:3	18

Контрольні питання

1. Назвіть речовини, які використовують для стерилізації рослинного матеріалу.

2. Які характеристики рослинного матеріалу необхідно враховувати, вибираючи речовину для стерилізації?

3. Назвіть загальні правила стерилізації рослинного матеріалу.