Міністерство освіти і науки. Молоді та спорту України
Чорноморський державний університет імені Петра Могили
Кафедра біології та екологічної безпеки
Г.Т. Федорович
С.Г. Лебідь
НАВЧАЛЬНИЙ ПОСІБНИК «ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ З КУРСУ «ОСНОВИ ЗАГАЛЬНОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ»»
для студентів напряму підготовки 6.040106 «Екологія, охорона навколишнього середовища та збалансоване природокористування»
Миколаїв 2013
Рекомендовано да друку вченою радою Чорноморського державного університету імені Петра Могили (протокол № ____ від ________)
Рецензенти:
Григор’єва Л. І. – доктор біологічних наук, професор, завідувач кафедри біології та екологічної безпеки Чорноморського державного університету ім. Петра Могили;
Черно В.С. – кандидат медичних наук, доцент, декан біологічного факультету Миколаївського національного університету ім. В.О. Сухомлинського
Лабораторний практикум присвячено питанням організації лабораторних робіт з мікробіології для студентів екологічних спеціальностей. Детально розглянуто методику проведення відповідних мікробіологічних досліджень, зокрема наведено інструкції, користуючись якими студенти можуть планомірно організувати свою роботу під час лабораторних занять. Крім того, наведено контрольні питання та завдання з кожної лабораторної роботи.
Зміст
Вступ
Лабораторна робота №1. Мікробіологічна лабораторія. Мікроскоп та техніка роботи з ним. Виготовлення мікроскопічних препаратів.
Лабораторна робота № 2. Морфологія бактерій. Простий метод фарбування.
Лабораторна робота №3. Паличкоподібні бактерії. Складні методи фарбування.
Лабораторна робота №4. Вивчення морфології та способів вегетативного розмноження цвільових грибів.
Лабораторна робота №5. Виготовлення поживних середовищ для мікроорганізмів. Види стерилізації.
Лабораторна робота №6. Методи виділення і культивування мікроорганізмів.
Лабораторна робота №7. Виділення чистих культур. Морфологічні та культурні ознаки мікроорганізмів.
Лабораторна робота №8. Дослідження мікрофлори грунту.
Лабораторна робота №9. Санітарно-мікробіологічні дослідження води.
Лабораторна робота №10. Аналіз мікрофлори повітря.
Лабораторна робота №11. Дослідження нормальної мікрофлори тіла людини.
Лабораторна робота №12. Аналіз якості кисломолочних продуктів.
Лабораторна робота №13. Бактеріологічний аналіз молока.
Лабораторна робота №14. Симбіотичні азотофіксатори (ознайомлення з бульбочковими бактеріями).
Література
Вступ
Мікробіологія – це наука про мікроорганізми, одна з провідних біологічних дисциплін. В біосфері Землі немає такого середовища, де б не зустрічалися мікроорганізми. Активна життєдіяльність величезної кількості, гігантська роль у колообігу речовин у природі має виняткове значення для підтримки динамічної рівноваги всієї біосфери, порушення якого призвело б до катастрофічних наслідків. Збереження природної рівноваги біосфери – це галузь інтересів сучасної екологічної науки. Саме тому мікробіологічні знання є досить необхідними для екологів, оскільки вони складають основу розуміння процесів саморегуляції в екосистемах різного рівня, в тому числі всієї біосфери.
Даний курс передбачає вивчення морфології, систематики, фізіології, біохімії та екології мікроорганізмів, їхньої ролі та значення у колообігу речовин, патології людини, тварин та рослин, дослідженню загальних умов життєдіяльності мікроорганізмів. Особлива увага приділяється дослідженню найчисленнішої групи мікроорганізмів – бактерій.
На межі мікробіології, епідеміології та гігієни виникла та набула свого величезного значення санітарна мікробіологія. Даний курс містить спеціальний розділ, присвячений саме основам цієї галузі мікробіології. Для фахівців – екологів ці знання є необхідними, оскільки санітарна мікробіологія вирішує такі завдання як: бактеріологічне дослідження води, ґрунту, повітря тощо, оцінка шляхів впливу людини та тварин на навколишнє середовище, шо можуть стати причинами його бактеріологічного забруднення, розробка державних санітарних стандартів щодо мікрофлори навколишнього середовища. В програмі курсу передбачено низку лабораторних робіт, що присвячені ознайомленню студентів з методиками санітарно-бактеріологічних досліджень та їх опрацюванню. Крім того, заплановано ознайомлення майбутніх фахівців з сучасними методиками екологічних досліджень, в яких використовуються мікроорганізми.
Лабораторний практикум покликаний допомогти студентам при підготовці до занять і у проведенні лабораторних робіт. Теоретична підготовка за усіма темами повинна проводитись за підручником та лекційним матеріалом. Засвоєння навчального матеріалу систематично контролюється питаннями для самоперевірки, які наведені в кінці кожної теми.
Лабораторна робота №1
Тема: Мікробіологічна лабораторія. Мікроскоп та техніка роботи з ним. Виготовлення мікроскопічних препаратів.
Матеріали та обладнання. Світлові мікроскопи марки МБР-1, МБИ, Биолам, лампи розжарення, мікробіологічні петлі, газові пальники, набори для мікроскопування (предметні і покривні стекла, барвники фуксин і метиленовий синій, фільтрувальний папір, гліцерин, кристалізатор з підставкою для препаратів), штативи для пробірок, об’єкти для мікроскопування (розсіл квашених огірків або капусти, кисломолочний продукт).
Мета роботи:
1. Ознайомитися з будовою мікроскопів марки МБР-1, МБИ, Биолам.
2. З розсолу огірків або капусти виготовити препарат «роздавлена крапля», розглянути під мікроскопом (40х) і зарисувати.
3. З кислого молока або іншого кисломолочного продукту виготовити фіксований забарвлений (метиленовий синій, 5хв) препарат, розглянути його під мікроскопом (90х) і зарисувати.
Мікробіологічна лабораторія і правила роботи в ній
Сучасна мікробіологічна лабораторія – це комплекс приміщень, обладнання і приладів, які забезпечують роботу з культурами мікроорганізмів. До її складу входять: кімната для мікробіологічних досліджень, або навчальна лабораторія, стерилізаційна, посівна (бокс), мийка і лаборантська кімната. Всі приміщення повинні бути добре освітлені і вентильовані, стіни на висоту до 170 см від підлоги пофарбовані масляною фарбою або викладені плиткою (для вологого прибирання із застосуванням дезінфікуючих розчинів). Лабораторне приміщення обладнане шафами, де зберігаються апаратура і реактиви, термостатом для вирощування мікроорганізмів і лабораторними столами, покритими термо- і хімічно стійким матеріалом, лабораторними стільцями. На лабораторних столах до кожного робочого місця підведено електроенергію і газ (встановлені газові пальники Теклю).
При виконанні робіт необхідно додержуватися таких правил:
У лабораторію заборонено входити у верхньому одязі і класти на лабораторні столи сумки та інші особисті речі, які можуть заважати роботі.
У приміщенні лабораторії необхідно підтримувати порядок і чистоту, працювати в халатах.
Робочу місце має бути обладнане усім необхідним для проведення лабораторних занять: мікроскопом, лампою, штативом для пробірок з культурами, бактеріологічною петлею тощо. За справність приладів несе відповідальність студент.
Інструменти, які використовували для роботи з культурами мікроорганізмів (петля, пінцет), необхідно прожарювати на вогні.
У лабораторії заборонено споживати їжу, пити воду.
У випадку попадання досліджуваного матеріалу на шкіру, халат, стіл необхідно негайно повідомити про це викладача і під його контролем провести дезінфекцію.
Усі живі препарати після мікроскопування, а також піпетки і шпателі, якими користувалися, необхідно занурити у склянку з дезінфікуючою рідиною (2%-ий розчин хлораміну).
Після закінчення занять необхідно навести порядок на робочому місці.
Мікроскоп та техніка роботи з ним
Для вивчення будови мікроорганізмів використовують різні мікроскопи, які забезпечують збільшення досліджуваних об’єктів у сотні (світловий мікроскоп) і десятки тисяч разів (електронний мікроскоп).
Найпоширенішими моделями сучасного біологічного мікроскопа, які дають змогу вивчати об’єкти у світлі, що проходить через лінзи, є мікроскопи марки МБИ, МБР, Биолам (рис.1), Ergaval та ін. Ці мікроскопи мають механічну та оптичну частини.
Рисунок 1 Мікроскоп «Біолам» з бінокулярною насадкою
1 – окуляри; 2 – бінокулярна насадка; 3 – револьвер; 4 – об’єктив; 5 – предметний столик; 6 – конденсор; 7 – дзеркало; 8 – гвинт переміщення кронштейна конденсора; 9 – мікрогвинт; 10 – макрогвинт; 11 – тубусотримач; 12 – гвинт для кріплення насадки.
Механічна частина мікроскопа МБР-1 складається зі штатива з предметним столиком і тубуса. Предметний столик має квадратну або круглу форму і його можна зміщувати за допомогою спеціальних гвинтів. Під предметний столиком на штативі закріплений кронштейн конденсора, який переміщується в межах 20-ти мм за допомогою гвинта конденсора. Верхню частину штатива (тубусотримач) приводять у рух обертанням мікрометричного і мікрометричного гвинтів призначених для грубого і тонкого фокусування зображення.
Оптична частина мікроскопа складається з освітлювального апарата, об’єктивів і окуляра. Освітлювальний апарат – це дзеркало або вмонтований у мікроскоп освітлювач (найчастіше марки ОИ-32) і конденсор, який закріплений над дзеркалом або освітлювачем і складається з декількох лінз. Конденсор призначений для фокусування паралельних променів, які йдуть від джерела світла, у площині препарату. Тому при роботі з конденсором слід користуватися лише плоскою стороною дзеркала. В корпусі конденсора вмонтовані ірисова діафрагма, за допомогою якої регулюється освітлення поля зору мікроскопа, і відкидна оправа для світлофільтра. У мікроскопах деяких марок конденсор оснащений додатковою відкидною лінзою, яку використовують найчастіше при роботі з об’єктивами малих збільшень.
Найважливішою деталлю мікроскопа є об’єктив, який складається з системи лінз, вмонтованих у металеву оправу. Більшість марок мікроскопів мають зазвичай об’єктиви, які дають збільшення у 8, 40 і 90 разів, що завжди вказано на їхній оправі. Слід пам’ятати, що чим більше збільшення об’єктива, тим менша його відстань від препарату. Об’єктиви 8х і 40х називають сухими, оскільки під час роботи з ними між фронтальною лінзою об’єктива і препаратом на предметному склі знаходиться повітря. Об’єктив 90х занурюють у краплю імерсійної рідини (вода, гліцерин, кедрова олія), тому його називають імерсійним. Це збільшує показник заломлення середовища на межі з фронтальною лінзою і наближає його до показника заломлення скла (nскла = 1,52; nводи = 1,3; nгліцерину = 1,47; nкедрової олії = 1,52). Занурення (імергування) об’єктива підвищує роздільну здатність мікроскопа до 0,2 мкм. Масляний імерсійний об’єктив має на оправі чорне кільце. Об’єктиви кріпляться у гніздах револьвера, обертанням якого здійснюється заміна одного об’єктива іншим.
Окуляр містить дві лінзи – верхню (очну) і нижню (збірну) і служить для розгляду зображення препарату, яке дає об’єктив, тобто виконує роль лупи. Окуляри можуть давати збільшення у 5, 7, 10, 15 і 20 разів, що вказано на їхній оправі. Окуляри бувають прості і більш складні – компенсаційні, про зо свідчить індекс «К» на оправі. Багато сучасних світлових мікроскопів є бінокулярними.
Збільшення, яке дає мікроскоп, визначають з добутку збільшення окуляра на збільшення об’єктива. Чіткість зображення визначають за роздільною здатністю мікроскопа, яка залежить від довжини хвилі світла і числової апертури оптичної системи мікроскопа, яка в свою чергу є мірою кількості світла, що потрапляє на лінзу. Числова апертура об’єктива вказана на його оправі, наприклад 0,20 (об’єктив 8), 1,25 (об’єктив 90). Конденсори зазвичай мають числову апертуру 1,2 або 1,4.
Роздільна здатність мікроскопа визначається і тим, як освітлений препарат. Неправильне освітлення не лише знижує якість зображення, але й призводить до виникнення оптичних явищ, які помилково можна прийняти за структури, властиві досліджуваному об’єктові. Тому світловий мікроскоп потрібно правильно підготувати до роботи.