Описание порядка выполнения измерений

Порядок измерения световых кривых с помощью прибора WaterРАМ.

Для проведения измерений необходимо последовательно выполнить следующие действия:

1. Запустить программу wincont.exe. На экране компьютера появляется интерфейс программы.

2. При усилении Gain-2 в вкладке Light Curve измерить световую зависимость. Для этого в правом верхнем окне Online Parameter дождаться пока сигнал фоновой флуоресценции Ft перестанет сильно меняться и остановится на одном уровне сигнала.

3. Начать измерение световых зависимостей Ft, Fm’, Yield, qN, NPQ, rETR нажатием на «Start» в интерфейсе программы. Повторность измерений должна быть трехкратной, для дальнейшего усреднения полученных результов (если во время измерений обнаружится выпадение точек, то следует переизмерить новый образец).

4. После завершения измерений сохраните файл в расширении csv, затем экспортировать его в Excel.

5. Распечатать полученные графики и закрыть программу.

Порядок измерения индукционных кривых с помощью прибора AquaPen.

1. Для проведения измерений необходимо последовательно выполнить следующие действия:

2. Запустить программу FluorPen.exe. На экране компьютера появляется интерфейс программы.

3. Подключить к USB порту Bluetooth и установить соединение с прибором в меню Setup/ Device ID. В нижнем левом углу вместо Device: Not connected появится Device: AquaPen.

4. В меню Device открыть Online Control. В интерфейсе программы откроется окно Online Control

5. Измерить индукционные кривые нажатием на OJIP в окне Online Control.

6. Рассчитать параметры индукционных кривых по JIP-тесту (см. таблицу).

7. Сохранить результаты в меню нажатием Safe в файловом расширении .dat. Далее файл .dat сохранить в .cvs формате с последующим экспортом его в Excel.

Порядок измерения индукционных кривых с помощью прибора M-PEA2.

1. Для проведения измерений необходимо последовательно выполнить следующие действия:

2. Запустить программу M-PEA Plus V1.07. На экране компьютера появляется интерфейс программы.

3. В программе M-PEA Plus V1.07 войти в подпрограмму M-PEA protocol нажатием на значок в верхней части интерфейса . Войти в папку и открыть нужный протокол и загрузить нажатием на Upload. Затем закрыть M-PEA protocol.

4. Начать измерение индукционной кривой (OJIP), замедленной флуоресценции и окисления Р₇₀₀ нажатием на в интерфейсе программы. Повторность измерений должна быть трехкратной, для дальнейшего усреднения полученных результатов.

5. После завершения измерений сохраните файл в расширении scs. Затем открыть сохраненные файлы в программе M-PEA-data-analyzer V.5.3.

6. Распечатать полученные графики и закрыть программу.

Оформление результатов и их обсуждение

• Построить графики зависимостей F₀, F_m и F_v / F_m от времени инкубации при разных концентрациях сульфата меди (в процентах от контроля).

• Для опытных образцов с изменениями в значении F_v/F_m в 20-30 % построить графики световых зависимостей параметров флуоресценции F_t, F_m', Yield, qN, NPQ, rETR и сравнить с параметрами контрольного образца (см. для примера рис.7. с сульфатом меди).

• На основании полученных световых кривых rETR рассчитать следующие фотосинтетические параметры: коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона световых кривой, α), максимальную относительную скорость электронов по электрон транспортной цепи (rETR_max) и насыщающую интенсивность света (Е_н). Данные представить в таблице и сравнить с контрольным образцом (см. для примера таблицу с медью).

• Если для каждой пробы делалось несколько измерений, то определить перечисленные соотношения для каждого из зарегистрированных кривых, а в итоговую таблицу внести средние значения и стандартное отклонение или ошибку среднего.

• Для опытных образцов с изменениями в значении F_v/F_m в 20-30 % построить и рассчитать параметры индукционных кривых флуоресценции (расчет по JIP-тесту). Данные представить в таблице и сравнить с контрольным образцом.

• Представить в удобной для восприятия форме результаты проведенных экспериментов и провести обсуждение их и сделать четкие выводы по полученным результатам; Отметить параметры флуоресценции, которые наиболее сильно изменяются при повреждении культуры в присутствии наночастиц.

Ниже для примера приведены результаты, полученные в опытах по исследованию действию ионов меди на параметры флуоресценции водорослей..

Рис. 6. Изменения параметров флуоресценции в зависимости от интенсивности действующего света в суспензии клеток водорослей Scenedesmus quadricauda под воздействием CuSO₄. Время инкубации 1 сутки. A – квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в фотосистеме 2 как отношение Y= (F_m'-F_t)/F_m', B - относительная скорость нециклического электронного транспорта, C - нефотохимическое тушение NPQ=(F_m/F_m')-1. (1) - контроль , (2), (3) - после добавления CuSO₄ в концентрациях 2·10^-5М и 5·10^-5М , соответственно.

Таблица. Изменения параметров световых зависимостей флуоресценции клеток C. reinhardtii в контроле и после CuSO₄ (суточная инкубации)

Параметры световых кривых	Контроль	10-5М	2·10-5М	5·10-5М
Fv/Fm	0.66	0.67	0.48	0.31
NPQ 25 μE/м2с	0.13	0.13	0.12	0.17
NPQ 400 μE/м2с	0.74	0.63	0.56	0.44
rETRmax	52.4	49.8	24.1	8.2
α, угол наклона	0.21	0.21	0.14	0.07
Енас, rETR μE/м2с	249	237	172	117

где, F_v/F_m – параметры проб в темноте; Y= (F_m'-F_t)/F_m' - фотохимическая активность ФС 2на свету;. нефотохимическое тушение NPQ; Параметры, описывающие зависимость электронного транспорта (rETR) от освещенности (световые кривые): коэффициент максимальной утилизации световой энергии, угол наклона световой кривой (α), максимальная относительная скорость нециклического транспорта электронов (rETR _max) и насыщающая интенсивность света (Е_н).

На рис.7. представлены исследования влияния солей CuSO₄ на водоросли на новом приборе М-РЕА2. Это прибор позволяет одновременно оценить влияние загрязнений на работу ФС2 по индукции флуоресценции, ФС1 ( по Р700) и процессы энергизации фотосинтетических мембран по индукции замедленной флуоресценции.

Кривая индукции быстрой флуоресценции O-I-D-P была описана выше. Она протекает за 1–3 с в зависимости от интенсивности света и других факторов. Более медленные изменения индукции флуоресценции P-S-M-T происходят за время от нескольких десятков секунд до нескольких минут. В типичной индукционной кривой ЗФ зеленого листа или водорослей при включении возбуждающего света различают несколько фазовых переходов. Эту кривую индукции можно описать наличием пиков I₁–I₆ (Рис. 7 Б). Пики максимумов кривой ЗФ в миллисекундном диапазоне (I₁ и I₂) совпадают с возрастанием F_j→F_i и F_i→F_p и отражают редокс-переходы на акцепторной стороне ФС2. Пик I₁ совпадает с периодом максимальной скорости нарастания быстрой флуоресценции F_j→F_i. Поэтому образование I₁ может быть обусловлено несколькими феноменами: фотохимическим тушением – накоплением определенных редокс-состояний, отвечающих за рекомбинацию зарядов и испускание квантов замедленной флуоресценции (т.н. высвечивающие состояния); нефотохимическим тушением – усилением ЗФ за счет электрического градиента на мембране.

I₂ обычно наблюдается, когда быстрая флуоресценция возрастает в фазе F_i→F_p. В этот момент пул хинонов восстанавливается, происходит снижение восстановленности P₇₀₀⁺ и величины трансмембранного электрического градиента. Быстрая и медленная фаза разделены минимумом D₂. Этот минимум совпадает с максимумом быстрой флуоресценции F_p и с максимальной концентрацией восстановленного P₇₀₀. Когда максимум F_p достигнут, пул хинонов восстановлен и акцепторная часть ФС1 неактивна. Наличие пиков ЗФ (I₄ и I₅) в секундном диапазоне может быть связано с фотоиндуцированным градиентом протонов и, с другой стороны, с активацией темновых реакций фотосинтеза. Провал D₂ совпадает с максимальным уровнем F_p, что может быть связано с закрытием реакционных центров ФС2 при сверхвосстановленности пула хинонов. Максимум I₄ предположительно связан с трансмембранным градиентом протонов, который увеличивает константу скорости излучательных переходов в РЦ ФС2. Появление максимума I₆ связано с активацией цикла Кальвина и синтезом АТФ и НАДФH.

Одновременное измерение кинетической кривой ΔA₈₁₀ на этом приборе показывает, что действие света у темноадаптированного объекта вызывает начальное окисление P₇₀₀ (с максимумом накопления P₇₀₀⁺ при t ≈ 30 мс), которое сменяется восстановлением P₇₀₀⁺ до уровня с более высоким содержанием формы P₇₀₀ по сравнению с исходным состоянием. При этом сигналы флуоресценции и ΔA810, отражающие восстановление Q_А и P₇₀₀, достигают плато примерно синхронно. Параллельное накопление восстановленных форм P₇₀₀ и Q_А отражает восстановление переносчиков на всем участке ЭТЦ между фотосистемами в связи с отсутствием оттока электронов из акцепторной части ФС1 в условиях, когда FNR инактивирована вследствие темновой инкубации. При длительности освещения ~10 c наблюдали вторую волну окисления P₇₀₀, которую объясняют оттоком электронов от ФС1 при активации FNR и активацией цикла Кальвина. То есть одновременная регистрация индукции быстрой и замедленной флуоресценции, а также изменений Р₇₀₀ позволяет следить за отдельными реакциями накопления восстановленных переносчиков между фотосистемами, включением ФС1 и кинетикой электрохимического градиента протонов на тиллакоидной мембране.

При регистрация на флуориметре М-РЕА2 образцов, обработанных CuSO₄ наблюдалась уменьшение индукции быстрой флуоресценции, что указывает на ингибирование вклада фотохимической фазы J-I-P, и свидетельствует о нарушении фотосинтетического потока электронов в ФС2 . Кроме того в присутствии CuSO₄ регистрируется низкая интенсивность замедленной флуоресценции, что свидетельствует об ингибировании энергизационных процессов на тиллакоидной мембране. Соли меди влияют также на окислительно-восстановительные процессы в фотосистеме1 по изменениям поглощении при длине волны 810.

Рис.7. Индукционные кривые быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла и изменение поглощение при длине волны 820 нм, отражающее изменения пигмента ФС1-Р₇₀₀ после включения освещения на контрольных образцах водорослей Scenedesmus quadricauda к контроле (1) и в присутствии CuSO₄ (2). Интенсивность подсветки 1200 μЕ/м²с. Одновременные измерения всех параметров на приборе М-РЕА2.

Дополнительные вопросы

• Природа быстрой флуоресценции хлорофилла у водорослей?

• Методика регистрации фотохимического и нефотохимического тушения флуоресценции и расчет относительной скорости нециклического транспорта электронов при фотосинтезе?

• Связь параметров индукционной кривой флуоресценции с конкретными реакциями фотосинтеза?

• Какую информацию можно получить о действии тяжелых металлов на водоросли при использовании методов регистрации световых и индукционных кривых флуоресценции?

• Какие еще методы можно использовать для контроля качества водной среды при действии тяжелых металлов?

ЛИТЕРАТУРА

Маторин Д. Н., Рубин А. Б. Флуоресценции хлорофилла высших растений и водорослей. М.: – Ижевск: ИКИ-РХД, 2012. 256 с.

Маторин Д.Н., Осипов В.А., Рубин А.Б. Методика измерений обилия и индикации изменения состояния фитопланктона в природных водах флуоресцентным методом. Теоретические и практические аспекты // Учебно-методическое пособие. М.: Альтрекс. 2012. 131 с.

Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов // Министерство природных ресурсов РФ РЭФИА. НИА. М.: Природа. 2002. 117c.

Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей. ФР.1.39.2007.03223. / Н.С. Жмур, Т.Л. Орлова // Москва, Акварос. 2007. 48 с.

Методика измерений обилия и индикации изменения состояния фитопланктона в природных водах флуоресцентным методом // Маторин Д. Н.,Осипов В. А., Рубин А. Б. и др. ФР.1.39.2011.11246, ПНДФ14.2.268-2012.М.:, Альтрекс. 2012. 35 с.

Филенко О.Ф. Водная токсикология // М.: Изд. Черноголовка. 1988. 156 с.

Schreiber U. Chlorophyll fluorescence as a nonintrusive indicator for rapid assessment of in vivo photosynthesis / U. Schreiber [et all.] // In: Shulze ED. Caldwell MM (eds) Ecophysiology of photosynthesis. Springer. Berlin. 1994 .Р. 49-70.

Vavilin D.V, Polynov V.A.,Matorin D.N., Venediktov P.S. The subletal concentrations of copper stimulate photosystem II photoinhibition in Chlorella pyrenoidosa // J. Plant Physiol. 1995. V. 146 (5-6). P. 609-613.