Занятие 3

Ингредиенты

Ход исследования

Результат

Выделенная культура

На предметное стекло нанести отдельно по капле агглютинирующие диагностические сыворотки и физраствор (контроль), В каждую каплю внести петлей испытуемую культуру и размешать легким покачиванием стекла. Через 2-3 мин отметить, в какой капле сыворотки произошла агглютинация. В контрольной капле должно быть легкое помутнение

Ингредиенты

Номера пробирок и разведений

1

1:50

2

1:100

3

1:200

4

1:400

5

1:800

6

К

Сыворотка (1:50) на 8 день болезни или сыворотка (1: 50) на 15 день болезни

1,0

1,0

вылить

Физраствор

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Брюшнотифозный эритроцитарный диагностикум

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА или РПГА) является разновидностью реакции агглютинации, которая основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности растворенные антигены и гаптены (бактерий, вирусов и др. микроорганизмов). При этом эритроциты несут новую серологическую специфичность и вместе с ней способность агглютинироваться иммунными сыворотками, гомологичными адсорбировавшимся антигенам. Это – эритроцитарные диагностикумы, для получения которых эритроциты обычно подвергают обработке танином в разведении 1:20000, под действием которого улучшается их адсорбционная способность. Реакцию ставят на полистероловых досках с лунками или в пробирках. Исследуемую сыворотку предварительно инактивированную при t 58 С^о в течение 30 минут для уничтожения комплемента, разводят от 1:10 до 1:12 000 и более, разливают в лунки по 0,5 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию выдерживают в течение 2-х часов при комнатной t, или в термостате и считают положительной, если осадок эритроцитов имеет форму зонтика с зубчатыми краями и покрывает почти все дно пробирки. При отрицательном результате эритроциты оседают в центре дна лунки в виде компактного диска с ровными краями - пуговки.

Номера пробирок

1опыт

2 опыт

3 опыт

Преципитирующая сыворотка против белка крови человека 0,5 мл

Нормальная сыворотка 0,5 мл

Физиологический раствор 0,5 мл

Смыв кровяного пятна 0,5 мл

Смыв кровяного пятна 0,5 мл

Смыв кровяного пятна 0,5 мл

Учет реакции проводят через 1-2 минуты

Заключение:

Реакция преципитации

Феномен прецепитации – эффект укрупнения растворимых антигенных субстанций (преципитиногенов) под влиянием антител (преципитинами) с возникновением помутнения прозрачных растворов.

Выпадение нерастворимого комплекса антиген + антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов. Реакция преципитации служит для выявления антигена по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела; сыворотку получают иммунизацией животных соответствующим антигеном.

А. Для постановки реакции кольцепреципитации в узкие пробирки диаметром 0,5 см наливают по 0,1 мл диагностических сывороток против различных антигенов микробного или иного происхождения (число пробирок по числу имеющихся ингредиентов), а затем осторожно по стенке пробирок наслаивают пастеровской пипеткой изучаемый материал. Учет реакции производят через 1-2 минуты. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде белого кольца. В контролях преципитата нет.

Б. Реакция преципитации в геле позволяет проводить анализ сложного набора растворимых антигенов или преципитирующих антител в испытуемых системах. Принцип метода заключается в том, что антиген и антитело, реагируя в геле, образуют преципитат, который проявляется в виде линии белого цвета. Каждая пара антиген + антитело образует независимую линию преципитации, что позволяет сравнивать антигенный состав испытуемых веществ.

В зависимости от техники постановки различают:

1. Метод простой (одинарной) диффузии, при котором готовится слой агарового геля, смешанный с иммунной сывороткой и в лунку, сделанную в этом слое, вносится антиген.

2. Метод двойной диффузии по Оухтерлони, при котором антигены и антитела вносятся в разные лунки агарового геля и диффузируя в среду, встречаются, образуя линии преципитата. Для постановки реакции по данному методу чашки заливают просветленным агаром, в котором делают лунки на равном расстоянии друг от друга.

3. В центральную лунку вносят антитела, в лунки по периферии – испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. Чашку закрывают крышкой и оставляют опыт при комнатной температуре на 24 - 28 часов.

Возможны следующие виды результатов:

1. Реакция идентичности: полосы преципитации, образованные антигенами А и В и антисывороткой, сливаются друг с другом – сравниваемые антигены серологически тождественны.

2. Реакция неидентичности: полосы преципитации перекрещиваются: сравниваемые антигены серологически различны.

3. Реакция частичной идентичности: полосы преципитации в основном сливаются, но образуют остаток (шпора), что указывает на содержание антител как к общим детерминантам сравниваемых антигенов, так и к детерминантам, отсутствующих у одного из них.

Ингредиенты, мл

Пробирки

1

2

3

4

5

6

7

Испытуемая сыворотка, 1:5

0,2

-

-

0,2

-

-

-

Положительная сыворотка

-

0,2

-

-

-

-

-

Отрицательная сыворотка

-

-

0,2

-

-

-

-

Антиген

0,2

0,2

0,2

-

0,2

-

-

Физиологический раствор

-

-

-

0,2

0,2

0,4

0,8

Комплимент

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

-

Инкубация при 37 ^ОС – 30 мин

Гемолитическая система

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

Инкубация при 37 ^ОС – 30 мин

Результат

Заключение:

Объяснить результаты, полученные в каждой из 7 пробирок:

• почему произошел или не произошел лизис эритроцитов;

• на основании каких данных судят о положительной или отрицательной реакции.

Получают взвесь выделенной культуры

Вносят штамм Cowan – 1

Положительная агглютинация говорит о хронической инфекции

Реакция коагглютинации

Разновидность реакции агглютинации, основанная на способности белка А стафилококка неспецифически связываться с Fc-фрагментом молекулы иммуноглобулинов класса G (IgG).

Для постановки реакции коагглютинации используют штамм Cowan – 1 стафилококка (отсюда и происходит название метода – Со (Ко) – агглютинация).

Реакцию коаглютинации используют в двух вариантах:

1. Для обнаружения антигенов патогенных микроорганизмов в различных биологических жидкостях (моча, отделяемое слизистых, спинномозговая жидкость и др.). Для этого готовят антительный Ко-диагностикум: на поверхность клеток стафилококка адсорбируют специфические IgG к исконному антигену. При наличии Аг в исследуемом материале происходит быстрая агглютинация внесенного Ко-диагностикума.

Схема постановки

а) приготовление Ко-диагностикума

б) внесение в исследуемый материал, соединяющий Аг

Клиническое значение. Вариант используется для быстрой диагностики коклюша, менингококковой инфекции и др.

2. Для диагностики хронических бактериальных инфекций.

Возбудители, выделяемые при хронических инфекциях, несут на своей поверхности специфические антитела, поэтому дают реакции агглютинации с клетками штамма Cowan-1 стафилококка.

Клиническое значение. При пиелонефрите выделяются различные условно-патогенные бактерии (E. coli, синегнойная палочка, эпидермальный стафилококк и т.д.). Если выделенная культура дает реакцию агглютинации с Cowan-1, то это говорит о хронической инфекции.

Метод иммуноэлектрофореза

чувствительный и специфичный, позволяет выявить и различить вещества-антигены, содержащиеся в многокомпетентной системе и в низких концентрациях.

Иммуноэлектрофорез основан на сочетании двух методов - электрофореза и преципитации в геле, техника постановки включает 2 этапа:

1. Исследуемое вещество (антиген) разделяют при помощи электрофореза в геле на составные компоненты, обладающие различной электрофоретической подвижностью. Для этого расплавленный агаровый гель наливают на стеклянную пластинку, после застывания в центре делают лунку, в которую вносят испытуемое вещество, затем пластинку помешают в аппарат для электрофореза. Отдельные компоненты исследуемого вещества распределяются по оси миграции в разных зонах и могут быть выявлены с помощью специальной окраски.

2. Проводят реакцию преципитации в геле, добавляя в тот же гель иммунную сыворотку (по окончании электрофореза), для этого параллельно оси миграции вырезают канавки в геле и заливают в них иммунную сыворотку. Антитела и разделенные электрофорезом антигенные компоненты диффундируют в геле навстречу друг другу, встречаются и образуют нерастворимые преципитаты, имеющие вид дуг различной кривизны и расположения. При этом каждый антиген реагирует отдельно со своим гомологичным антителом и дает независимую дугу.

Клиническое значение. Метод иммуноэлектрофореза позволяет определять число антигенных компонентов исследуемого материала, идентифицировать их по электрофоретической подвижности и по характеру дуг преципитации со специфической сывороткой.

Иммунофлюоресцентный метод

Позволяет сочетать иммунологические и серологические исследования, а также сочетать морфологические исследования с серологическими. С его помощью удается быстро (за 1- 2 часа) обнаружить различные микробные антигены (бактерий, риккетсий, вирусы и др.) или антитела, определять их точное нахождение в тканях и органах. Метод диагностики основан на взаимодействии антигенов со специфическими антителами, меченными флюорохромными красителями. С помощью люминисцентного микроскопа эти антигены (связанные с антителами) выявляются в виде светящихся изображений на несветящемся фоне препарата.

При проведении микробиологических исследований применяют прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции. Метод применяется в качестве диагностического экспресс-метода при многих инфекционных заболеваниях в практической микробиологии и вирусологии.

Иммуноферментный метод

На стенки полистероловых пробирок сорбированы антитела против определенного антигена: вносят исследуемый препарат, сливают и добавляют специфические антитела, меченные ферментом (чаще пероксидазой хрена). Содержимое пробирок заменяют на смесь хромогена с субстратом для данного энзима – Н₂О₂. Энзим фиксируется на стенках, разложит Н₂О₂ на воду и кислород, окрасит хромоген в желтый цвет.

Радиоиммунологический метод

Учет реакции антиген-антитело может осуществляться с помощью радиоизотопных методов в случае использования “меченых” антител или антигенов.

Изменение радиоактивности перципитата дает возможность оценить количество антител или антигена в исследуемых образцах.