Методические указания к заданию 2

Воспроизведение экспериментальной инфекции.

Заражение лабораторных животных проводят с различными целями:

А. для диагностики инфекционных заболеваний, выделения возбудителя биологическим методом;

Б. для определения вирулентности микробов;

В. для определения токсигенности, изучения действия токсинов;

Г. для создания модели инфекционной болезни и изучения патогенеза, лечебного действия различных препаратов, изменчивости микробов-возбудителей;

Д. для проверки профилактической и лечебной активности вакцин, сывороток и других биологических препаратов.

Заражение животных производят различными способами: подкожно, внутрикожно, накожно, внутримышечно, внутрибрюшино, внутривенно, перорально, в мозг, интраорбитально, эндонозально.

В зависимости от задач исследования, используемых видов животных: мышь, кролик, морская свинка, баран, куры.

Постановка опыта по определению хемотаксиса.

Таксис - это активное движение организмов под влиянием одностороннего стимула: света, температуры, кислорода, химических веществ и т.д. Такое активное движение является универсальным средством, помогающим микроорганизмам находить оптимальные биологические ниши. Смена направления движения позволяет бактериям активно тестировать окружающее пространство. Если бактерия попадает в пространственный градиент благоприятного стимула (аттрактанта), то суммарное перемещение, складывающееся из отдельных пробежек в разных направлениях, оказывается смещенным в сторону этого стимула.

Это происходит в результате функционирования системы таксис, основной смысл которого заключается в том, чтобы снизить вероятность остановки клетки, если направление движения приближает ее к источнику пространственного градиента концентрации аттрактанта. И, напротив, увеличить эту вероятность, если движение ведет в обратную сторону от этого источника.

В случае действия неблагоприятного стимула (репеллента) картина диаметрально противоположна действию аттрактанта. Снижение концентрации аттрактанта и увеличение концентрации репеллента приводит к отрицательному таксису. Снижение концентрации репелента и увеличение аттрактанта - к положительному таксису.

Хемотаксис является достоянием наиболее прогрессивных, с эволюционной точки зрения, бактериальных форм (энтеробактерии E. coli и S. typhimurium). В основе хемотаксиса лежит хеморецепция. У E. coli обнаружено полтора десятка хеморецепторов, воспринимающих информацию от нескольких десятков хемоэффекторов.

Способы регистрации хемотаксиса

Наиболее часто используются чашечные методы.

1. Для изучения трофического таксиса бактериальную суспензию инокулируют в центре чашки Петри, содержащей исследуемый хеморецептор в качестве единственного источника углерода в полужидком агаре. Используя хемоэффекторы в качестве субстрата, микроорганизмы создают его градиент и перемещаются по этому градиенту в форме кольца из центра чашки к периферии. По скорости образования хемотаксического кольца (диаметру) можно судить об эффективности субстрата как продуктивного аттрактанта. Время регистрации таксической реакции - около суток.

2. Пространственный градиент можно задавать диффузией хеморецептора из плотного в полужидкий агар. В чашку Петри помещают бактерии, которые ранее суспензировали в полужидком агаре. В суспензию помещают блоки, вырезанные из плотного агара, содержащего хеморецептор (или кусочки ткани). Хемоэффектор диффундируя из плотного агара в суспензию, формирует градиент. В случае аттрактанта, привлеченные градиентом бактерии образуют кольцо вокруг блока плотного агара. Для исследования отрицательного хемотаксиса в чашке с плотным агаром, содержащим репеллент, вырезаются колодцы, которые заполняются суспензией бактерий в полужидком агаре. Репеллент образует градиент, под действием которого клетки собираются в центре вырезанного колодца в виде плотной мутной точки. Время определения 20 - 60 мин.

Ингредиент

Номер пробирки

1

2

3

4

5

6

Гиалуроновая кислота

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Микробная взвесь

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

-

Физраствор

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

15,0 % уксусная кислота

3 к*

3 к

3 к

3 к

3 к

3 к

Результат

Заключение:

Метод определения гиалуронидазы

Готовится гиалуроновая кислота из пупочных канатиков. Для этого свежие пупочные канатики очищаются от крови, разрезаются, освобождаются от сосудов, измельчаются ножницами, взвешиваются, заливаются двойным количеством воды и варятся до оседания кусочков на дно (до кипения не доводить). Раствор пропускают через марлевый фильтр. Фильтрат является гиалуроновой кислотой.

2 млрд взвесь суточной агаровой культуры бактерий разливается в пробирки, добавляется рабочее количество гиалуроновой кислоты. Объем жидкости доводят до 1 мл физратвором. Добавляется по 3 капли 15 % уксусной кислоты. Ингредиенты осторожно смешивают и учитывают результат.

С уксусной кислотой гиалуроновая кислота должна давать сгусток.

Если штамм продуцирует гиалуронидазу высокой активности, муциновый комочек образуется только в шестой пробирке (контроль). В опытных пробирках жидкость будет равномерно мутной. Если активность фермента невелика, то образование сгустка наблюдается только в первых 2-х или 3-х пробирках. При отрицательной реакции во всех пробирках образуются сгустки

Методическое указание по определению цены деления окуляр-микрометра

Зону лизиса измеряют окуляр-микрометром, предварительно определив цену деления с помощью объект микрометра или сантиметровой линейки. Для этого объект-микрометр устанавливают на предметном столике микроскопа. Отмечают число делений объект-микрометра, в которые полностью укладываются число делений окуляр-микрометра и устанавливают величину деления объект-микрометра в мм.