2. Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминисцентной микроскопии.

Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминисцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминисцентного микроскопа и специальных красителей, всвязи с чем доступен лишь немногим лабораториям.

Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминисцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесители в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски. Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

3. Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H.Wallace и Joseph R. Culter в 1947 году. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.

Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов – относительное (процентное) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемое с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод), стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex-XT-200i) дополнительные инфармативыне ретикулоцитарные параметры:

1. Ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией).

2. Ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией).

3. Ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией).

4. Незрелая фракция ретикулоцитов (IFR%, Immature Reticulocyte Fraction).

Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности косного мозга.

Методика (анализатор Sysmex-XT-2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюорсцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Геморрагические диатезы

Собирательное понятие заболеваний, которые связаны с нарушением свертывания крови и характеризуются кровоточивостью.

Гемофилия

Является одной из классических форм геморрагических диатезов, обусловлена дефицитом одного из факторов свертываемости — VIII, IX или XI. Представляет собой генетическое заболевание, сцепленное с полом. Ген, ответственный за синтез VIII и IX факторов локализуется в Y-хромосоме. Вследствие чего заболевают исключительно мужчины. Заболевания гемофилией женщины возможно при браке больным гемофилией мужчиной и женщиной-носителем.

Заболевание, связанное с недостатком VIII фактора — гемофилия А. Частота 85-90%

Заболевания, связанное с недостатком IX фактора — гемофилия В (болезнь Кристмаса). Частота 10-15%.

Заболевание, связанное с недостатком XI фактора — гемофилия С (болезнь Розенталя).

Патогенез: повышенная кровоточивость с первых месяцев жизни. Концентрация VIII и IX фактора в крови очень низка. При дефиците одного из них нарушается процесс свертывания в первой фазе, т. е. образование тромбопластина, что и вызывает кровоточивость.

Лабораторная диагностика гемофилии: по удлинению времени свертывания и АЧТВ, время кровотечения и протромбиновое время не изменены, параметры тромбоцитарного гемостаза не нарушены. При тяжелых формах отмечается увеличение общего времени свертывания плазмы и снижение протромбина. Тип и тяжесть гемофилии определяют по снижению в плазме факторов VIII и IX.

Лечение: поддается лечению.

ДВС-синдром

Дессиминированное внутрисосудистое свертывание, коагулопатия потребления, тромбогеморрагический синдром.

Это нарушение свертываемости крови по причине массивного освобождения из тканей тромбопластических веществ. Часто встречается при различной акушерской патологии, различных видах шока, тяжелых травмах, бактериальном сепсисе.

Патогенез: чрезмерный синтез тромбина в сосудистом русле, что приводит к образованию тромбов внутри сосуда, а также истощению противосвертывающей системы крови. В большинстве случаев инициатором патологического процесса выступает тканевый тромбопластин — фактор III.

Изменения свертывающих факторов:

1. Количество тромбоцитов снижается до 60-120*10⁹/л (в зависимости от стадии)

2. Длительность кровотечения увеличивается.

3. Время свертывания крови удлиняется, т. к. развивается дефицит факторов свертывания вследствие их повышенного расхода в мелких сосудах пациента.

4. Д-димер и продукты деградации фибрина (вещества, выделяемые при распаде сгустков крови). В норме сгустки крови и продукты их распада в крови отсутствуют.

5. Проба щипка. Оценивается появление подкожных кровоизлияний при сдавлении складки кожи под ключицей. Проба положительна за счет снижения количества тромбоцитов и ухудшения состояния сосудистой стенки.

6. Проба жгута положительна за счет снижения количества тромбоцитов и ухудшения состояния сосудистой стенки.

7. Манжеточная проба положительна.

8. Протромбиновое время и отношение увеличивается.

9. Тромбиновое время повышается на второй стадии, укорачивается на первой стадии.

10. АПТВ повышается на второй стадии, укорачивается на первой стадии.

11. Концентрация фибриногена в плазме снижается при остром ДВС-синдроме.

Лечение представляет большие трудности. Летальность при остром синдроме 30%.