Микроорганизмдерді культивирлеу әдістері

Биотехнологиялық синтез технологиясы микроорганизмдер – продуцентінің қасиетіне қарай құрастырылады. Микроорганизмнің осы түрі үшін жағдайының жақсы болуы, тек өмір сүруіне қолайлы жағдай жасап, максимум мол өнім алуға мүмкіндік береді және синтездей алады .

Микроорганизм – продуцентін өсіру үшін, культивирлеудің беттік және түптік әдісі қолданылады.

Микроорганизмдерді беттік әдіспен өсіру технологиясы қарапайым болып келеді. Микроорганизмдер қатты немесе сұйық қоректік ортада культивирленеді. Қатты қоректік орта ретінде агарланған орталар немесе сусымалы субстраттар (бидай, арпа, бидай кебегі және т.б.) қолданылады. Агарланған қоректік орталарды зарарсыздандырып пробиркаға, Петри табақшасына құйылады.

Культура продуцентін қоректік ортаға еккеннен кейін пробирка мен Петри табақшасымен термостатқа қойылады, онда микроорганизмдердің белгілі бір температурада өсуі мен дамуы жүреді. Сусымалы субстратты біркелкі етіп арнайы кюветаларға орналастырады, егіс материалын салғаннан кейін өсіру камерасына қойылады. Микроорганизмдерді қолайлы жағдайда өсіру бірнеше күнге созылады. Микроорганизмдерді өсіру процесі аяқталған соң дайын өнім бөліп алынады. Беттік әдіспен микроорганизмдерді өсіру процесі белгілі бір уақытта аяқталады, сондықтан ол периодты болып саналады.

Арнайы аппарат–ферментерде сұйықтықтың барлық көлемінде қоректік ортада микроорганизмдерді түптік әдіспен өсіру жүргізіледі. Микроорганизмдерді түптік әдіспен өсіру периодты және үздіксіз болуы мүмкін. Периодты әдіспен түптік культивирлеу процесінде ферментерге бірден барлық қоректік орта және егіс материалының барлық көлемі салынады. Белгілі бір уақыт ішінде микроорганизмдерді өсіру қолайлы жағдайда жүргізіледі, кейде процесті тоқтатып ферментерден керегінше құйып алынып, дайын өнім бөліп алынады. Микроорганизмді өсіру үшін қолайлы жағдай жасалып, түптік культивирлеудің үздіксіз әдісі кезінде қоректік орта үздіксіз ферментерге келіп түсіріледі қосылады, ол ферментерден сондай-ақ культуралды сұйықтықтан микроорганизмдермен бірге үздіксіз ағылып шығарылып отырады.

Микроорганизмдердің периодты және үздіксіз процесі кезінде өсу жағдайы әртүрлі екендігі белгілі. Периодты процесс кезінде қоректік заттардың концентрациясы уақыт өткен кезде қоректік ортада азаяды, ал азықтық метаболизм құрамы көбейеді, ол микроорганизмдердің өмір сүруіне кері әсерін тигізеді. Үздіксіз процесс кезінде микроорганизмдердің өсуіне қолайлы жағдай жасалады, бұл екі көрсеткіш үнемі бірдей деңгейде болады.

Микроорганизмдерді периодты түрде культивирлеу

Егіс материалын алу барысында көбінесе культивирлеудің периодты әдісі қолданылады. Микроорганизмді культивирлеу кезінде компоненттер қоректік ортаға келіп түспей және одан шықпай тұрған кезде микроорганизмдер өсіріледі және көбейеді. Белгілі даму циклы өткен соң, фазаның ауысқаны көрсетіледі, осы жағдайда микроорганизм өседі және көбейеді.

Периодты культивирлеу микробты биосинтез процесімен танысқанда алдымен периодты культураның өсу динамикасын зерттеуден басталады. Периодты культураның дамуы үшін (көп клеткалы организмнің даму циклінің аналогы жоқ) ортаға егуден басталады. Егу мынадай мөлшерде іске асырылады, минимальды ұстаумен немесе лаг фазасыз микроорганизмнің адымен өсуімен қамтамасыз етіледі. Биосинтез барысында лаг фазаға түсінікті аз береді немесе өсу үшін қолайсыз жағадайымен куәланады. Көптеген микробиологиялық процесс үшін ортаның көлемінің 2%-дей мөлшері «жаңадан жасалған» егіс материалына қатысады.

Тізбектелген ауысу фазалары графикалық түрде көрсетілуі мүмкін. Сосудта жасушаның саны егіс материалын еккен кезден бастап анықтаса, әрбір уақыт мерзімі белгіленіп, абсцисса осіне жіберіледі, жасушаның белгілі санына сәйкестеліп ординат осіне жіберіледі (5-сурет). Бұл қисықты микроорганизмдердің өсу қисығы деп атайды және бірнеше фазаларға немесе периодтарға бөледі.

І фаза лаг-фаза немесе бейімделу фазасы деп аталады.Мұнда жаңадан жасалған қоректік ортаға жіберілген микроорганизмдер көбеймейді, қайта бейімделеді. Бұл фаза 1-2 сағатқа созылады. Фаза аяқталған кезде жасуша көбейе бастайды. Қоректік ортаны пайдалану қуатты түрде жүреді. Микроорганизмдер көбейгенге дейін қоректік орта инокуляторға енгізіліп отырады. Бұл периодта культура жаңа ортаға бейімделеді, бұл фазаның ұзақтығы микроорганизмдердің физиологиялық ерекшелігіне байланысты және культивирлеу жағдайына, егіс материалына және өндірістік орта құрамына байланысты. Мұндай айырмашылық аз болған сайын және егілетін микроорганизмдердің мөлшері неғұрлым көп болса, онда І фазаның өсуі соғұрлым қысқа болады.

5 сурет- Периодты культивирлеудегі микроорганизмнің өсу қисығы.

Х-биомассаның саны (1 мл жасуша саны); τ-уақыт,сағ.;

І-лаг фаза; ІІ-өсуін жылдамдататын фаза;

ІІІ-экспоненциальды фаза;

ІҮ-өсуін баяулататын фаза;

Ү-стационарлы фаза;

ҮІ-жойылу фазасы;

Қандайда бір өзгеріске ұшырауына қарамастан жасуша ішінде бірқатар биохимиялық өзгерістер болады. Жасушада рибосома саны және ақуыз құрамы көбейеді, ферменттік жүйелер активтеледі. Алдымен периодта популяция саны көбеймейді, бірақ жасушаның көлемі жоғарылайды.

ІІ фаза Өсу жылдамдығының фазасы немесе ауыспалы деп аталады. Бұл жасушаның бөліне бастауы болып сипатталады. Бұл сатыда жасушадағы нуклеин қышқылының (ДНҚ, РНҚ) ақуыздың құрамы жоғарылайды, жасушаның көлемі ұлғаяды. Жасуша беті белгілі қатынасы аралық жетістігінің арқасында және оның көлемі жасушаның бөлінуімен жүргізіледі, нәтижесінде культураның өсу жылдамдығы мен популяция саны ұлғая бастайды. Әдетте бұл фазаның жалғасы жоқ.

ІІІ фаза–Жасуша санының анағұрлым активті өсу фазасы. Даму фазасы көбейюдің ең активті фазасы. Онда микроорганизмдер қарқынды дамиды, өсу шапшаңдығы да арта түседі. Бұл екі сағаттай уақытқа созылады. Кейбір жасушалар тіршілігі тежеле бастайды. Ол экспоненциалды немесе логарифмдік фазаның өсуі деп аталады. Бұл фазада жасуша белгіленген өсу жағдайына толығымен бейімделгеннен кейін басталады, культураның өсуі қоректік зат түспесе де, азықтық заттың зат алмасуы мол болмаса да шектелмейді. Өсу жылдамдығының максимальдығы бекітіледі. Микроорганизм культурасының өсу процесін меңгеру кезінде абсолютті және меншікті өсу жылдамдығын ажырата білу қажет.

Абсолютті өсу жылдамдығының формуласы мынаған тең:

v

мұнда: х – биомасса саны (г/л) (немесе жасуша саны)

τ – уақыт, (сағ)

Меншікті өсу жылдамдығы биомасса бірлігінің өсу жылдамдығымен сипатталады және мына формула бойынша есептеледі:

,

мұнда: μ-уақыт бірлігіндегі биомассаның өсуі, сағ^-1.

Микроорганизмдер культурасының меншікті өсу жылдамдығы болып қандайда бір маңызды сипаты, организмнің өзі және сондай-ақ культивирлеу жағдайы саналады.

Меншікті өсу жылдамдығы мен субстрат концентрациясының арасында, культураның өсуі шектеледі, белгілі байланысы анықталып, Моно теңдеуі түрінде көрсетіледі:

мұндағы: μ_макс - максимальді меншікті өсу жылдамдығы;

S – субстрат концентрациясы;

K_S – қаныққан констант.

Өсудің меншікті жылдамдығы өнімдерге байланысты болады, жасушалардан зат алмасу процесі кезінде ортаға бөлінеді. Жасушалардың өсуін ингибитолар тежейтінін ескертетін теңдеу Моно – Иерусалим теңдеуі ретінде белгілі, келесідей түрде келтіріледі:

мұндағы: Р – жасушалар өсуін ингибирлейтін өнімнің концентрациясы;

К_Р – ингибирлеуші констант; өнім концентрациясына саны тең, бұл кезде өсудің меншікті жылдамдығы екі есеге төмендейді.

Популяцияның экспоненциальды өсу теңдеуі:

х=х_o е ^{μ макс τ},

мұндағы: Х_о – биомасса саны немесе уақыттың бастапқы кезеңіндегі жасушалар саны,

е – табиғи логарифмнің негізі.

Бұл теңдеуді логарифмдеуде аламыз:

ln _x = lnх_о+ μ_макс τ

Демек, биомасса мөлшерінің логорифмі және жасушаның саны тұрақты жылдамдықпен жоғарылайды. Сондықтан бұл фаза логарифмдік фаза деп аталады.

Микроорганизмдердің қарқынды өсуінің және қоректік ортадағы микроорганизмдердің көбеюінің нәтижесінде дәл осы қарқындылық пен қоректік заттар жұмсалады да, өмір сүруші микроорганизмдердің өнімдері жиналады. Сонымен қатар бос кеңістік шектеледі, жасушалар өсу барысында бір–біріне бөгет жасайды, жасушаларға қоректік заттардың келуі және метаболиттердің бөлінуі нашарлайды. Өсу жылдамдығы төмендейді, жасушалардың бөлінуі қысқарып, содан соң өсудің келесі фазасы басталады.

IV фаза – баяу өсу фазасы немесе өсу жылдамдығының төмендеуі. Бұл фазаның, экспоненциалды фазаға қарағанда жасушалар бітекті болмайды, себебі қолайсыз факторлардың әсерінен қоректік зат концентрациясы төмендейді, зат алмасуда өнімнің жиналуы өседі. Мұның барлығы культураның өсу процесінің баяулануына және тоқтап қалуына әкеліп соқтырады, сонымен қатар олардың жойылуы және жасушаларда лизес бөлігінің тууы мүмкін.

V фаза – стационарлы фаза деп аталады. Стационарлы фазада жаңадан пайда болған жасушалар мен қырылған жасушалар саны теңеледі. Сондықтан тірі жасушалар саны біраз уақыт тұрақты болып қала береді. Көбею кезінде түзілген өнімдер микробтар тіршілігіне нұсқан келтіре бастайды. Бұл фаза бірнеше сағаттан бірнеше күнге дейін созылады. Стационарлы фазада биомасса культурасының өсуі тоқтайды:

.

Бірақ ескере кету керек, бірнеше уақыт бойы бұл фазада биомассаның біршама өсуі болады, бұл стационарлы фазадағы жеке жасушалардың көбеюінің жалғасатынын түсіндіреді. Бірақ көбею процесі жасушалардың жойылу процесімен және олардың кейбіреуінің автолизімен теңеседі.

Биомасса өсуі стационарлы фазаға жеткенде культура биомассасының көп мөлшері және жасушаның максимал саны жиналады. Бұл максимал мөлшерін өнімнің жемісі немесе шығымы деп атайды.

Іс жүзінде сыртқы көзқарасқа қызығушылық тудырады, бұл экономикалық коэффициент деп аталады. Бұл көрсеткішті пайда болған микроорганизмдердің массасы мен жұмсалған субстрат мөлшерімен салыстыруға болады :

у = х/S .

Стационарлы фаза үшін жасуша популяциясының гетерогенді жоғарылауы сипатталған, онда бірқатар жеке көбейетін жасушамен бірге әлі тірі жасушалар да болады, бірақ олардың әрмен қарай өсу қабілеті жоғалып, өлі жасуша лизистеледі.

VI фаза – қырылу фазасы немесе жойылу фазасы. Қырылу фазасында пайда болған жасушалар санынан өлген жасушалар саны басым болады. Қоректік ортаның физикалық-химиялық қасиеті мүлде өзгеріп, микроорганизмдер тіршілігіне зиянды жағдайға көшеді. Жасушалардың қырылу жылдамдығы арта түседі. Ол өлген жасушалардың саны қайта пайда болған жасушалар санынан көп болған кезден бастап басталады. Бұл фазада жасушалардың өмір сүру жағдайлары қолайсыз, ал жасушалардың артық заттарының қоры таусылады.

Микроорганизмдерді периодты әдісте өсіру көптеген өндірістерде, егіс материалын алу сатысында қолданады, оның ең басты сатысы – ферментация, көптеген өндірістер үздіксіз немесе периодты әдіске байланысты емес. Үздіксіз культивирлеудің артықшылығына қарамастан, көптеген өндірістер периодты әдісті қолданады, ол микроорганизмдер продуценттерінің қасиеттерінің қиыншылығына байланысты. Сондықтан популяцияның даму сатысын білу, барлық технологиялық процестің жақсы өтуі үшін жоғарғы мәнге ие болады.