5 Сурет- Қоректік ортаны дайындаудың сызба нұсқасы:
1-3 – реакторлар; 4- фильтр; 5- араластырғыш-реактор.
Қоректік ортаны залалсыздау үшін екі әдіс қолданылады: периодты культивирлеу – циклді және үздіксіз культивирлеу - үздіксіз.
Қоректік ортаны залалсыздаудың циклді әдісі өте қарапайым. Бұл операцияны ферментердің өзінде-ақ жүргізуге болады. Көбінесе өткір және тұйық бумен комбинирлеп қыздыру арқылы бір мезгілде қондырғыны да, құрылғыны да залалсыздайды.
Өткір бу қоректік ортаға, ал тұйық бу жейдеге беріледі. Өткір буды сынама алу үшін, ауаны және егіс материалын беру үшін штуцер арқылы ферментерге жіберіледі.
Сондықтан ферментер барлық арматуралармен қосылған өткір бумен залалсыздайды. Қоректік ортаны өткір бумен залалсыздағанда конденсаттың пайда болуына әкеледі, ертеректе ортаның конденсатпен араласуын ескеру керек және дайындалатын қоректік ортаның рецептеріне сәйкес түзетулер жүргізіледі. Ортаны залалсыздаудың соңында барлық қоректік компонентердің қажет концентрациясы болады.
Циклді залалсыздау кезінде 1210С температураны ұстайды, өткір будың қысымы 100 кПА болады. Осындай температурада қоректік ортаны 30 – 40 минут ұстайды. Залалсыздаудан толығымен өткізу, қыздыру, ұстау, салқындату бірнеше сағатқа созылады. Егер де берілген уақытынан артық уақыт қыздыратын болса, қоректік ортаның құрамын белгілі химиялық өзгеріске әкеледі. Демек, микроорганизмнің тіршілік етуіне қажет, бірақ ыстыққа тұрақсыз заттар ыдырап кетеді. Кейбір жағдайда қыздырғанға төзімсіз қосылыстар ыдырайды, микроорганизм үшін қоректік заттың қажет өнімдерінің жоғалуына әкеледі. Кейбір қосылыстар өнім пайда болғанша бір-бірімен әрекетеседі, микроорганизмнің өсуін ингибирлейді.
Қоректік орта құрамындағы химиялық компонентердің өзгеруінің көбісі залалсыздау температурасына қарағанда жоғарғы температурада жүреді. Жоғарғы температураны қолдануға болады, қоректік ортаны тез қыздырғанда және салқындатқанда, залалсыздау кезінде қоректік ортаның минимальды өзгеруі тиімді деуге болады.
Көбінесе зауыттарда қолданылатын жоғарғы температурада үздіксіз залалсыздау әдісі қолданылады, ортаның қоректік сапасының минимум нашарлауына мүмкіндік жасайды, залалсыздаудың тиімділігін төмендетпейді.
Үздіксіз залалсыздау кезінде залалсыздау уақытын қысқарту арқылы будың шығымын азайтуға болады. Жоғарғы температураны қолдануда максималды температурада ортаны ұстаудың ұзақтығы тез қысқаруына мүмкіндік жасайды, ал периодты қыздыру және салқындату бірнеше секунтқа қысқаруы мүмкін. Егер қоректік ортада суспензияланған бөлшектер болмаса, онда 150-1600С температурада залалсыздауды жүргізеді.Осы кезде залалсыздалған ферментерге насос арқылы қоректік орта келіп түседі. Өте жоғарғы температурада ұстау уақытын қысқартады, сөйтіп қыздыруды және суытуды бірнеше секундта орындауға болады. Қазіргі кездегі залалсыздау температурасы 1350С, ал оны ұстау, тұндыру ұзақтығы 5 – 15 минутке созылады.
Микроорганизмдерді культивирлеу әдістері
Биотехнологиялық синтез технологиясы микроорганизмдер – продуцентінің қасиетіне қарай құрастырылады. Микроорганизмнің осы түрі үшін жағдайының жақсы болуы, тек өмір сүруіне қолайлы жағдай жасап, максимум мол өнім алуға мүмкіндік береді және синтездей алады .
Микроорганизм – продуцентін өсіру үшін, культивирлеудің беттік және түптік әдісі қолданылады.Микроорганизмдерді беттік әдіспен өсіру технологиясы қарапайым болып келеді. Микроорганизмдер қатты немесе сұйық қоректік ортада культивирленеді. Қатты қоректік орта ретінде агарланған орталар немесе сусымалы субстраттар (бидай, арпа, бидай кебегі және т.б.) қолданылады. Агарланған қоректік орталар залалсыздандырып пробиркаға, Петри табақшасына құйылады.
Культура продуцентін қоректік ортаға еккеннен кейін пробиркамен Петри табақшасымен термостатқа қойылады, онда микроорганизмдердің белгілі бір температурада өсуі мен дамуы жүреді. Сусымалы субстратты біркелкі етіп арнайы кюветаларға орналастырады, егіс материалын салғаннан кейін өсіру камерасына қойылады. Микроорганизмдерді қолайлы жағдайда өсіру бірнеше күнге созылады. Микроорганизмдерді өсіру процесі аяқталған соң дайын өнім бөліп алынады. Беттік әдіспен микроорганизмдерді өсіру процесі белгілі бір уақытта аяқталады, сондықтан ол периодты болып саналады. Арнайы аппарат–ферментерде сұйықтықтың барлық көлемінде қоректік ортада микроорганизмдерді түптік әдіспен өсіру жүргізіледі.
Микроорганизмдерді түптік әдіспен өсіру кезеңді және үздіксіз болуы мүмкін. Кезеңді әдіспен түптік культивирлеу процесінде ферментерге бірден барлық қоректік орта және егіс материалының барлық көлемі салынады. Белгілі бір уақыт ішінде микроорганизмдерді өсіру қолайлы жағдайда жүргізіледі, кейде процесті тоқтатып ферментерден керегінше құйып алынып, дайын өнім бөліп алынады. Микроорганизмді өсіру үшін қолайлы жағдай жасалып, түптік культивирлеудің үздіксіз әдісі кезінде қоректік орта үздіксіз ферментерге келіп түсіп қосылады, ол ферментерден сондай-ақ культуралды сұйықтықтан микроорганизмдермен бірге үздіксіз ағып шығарылып отырады. Микроорганизмдердің кезеңді және үздіксіз процесі кезінде өсу жағдайы әртүрлі екендігі белгілі. Кезеңді процесс кезінде қоректік заттардың концентрациясы уақыт өткен сайын қоректік ортада азаяды, ал метаболизм құрамы көбейеді, ол микроорганизмдердің тіршілік етуіне кері әсерін тигізеді. Үздіксіз процесс кезінде микроорганизмдердің өсуіне қолайлы жағдай жасалады, бұл екі көрсеткіш үнемі бірдей деңгейде болады.
Микроорганизмдерді кезеңді түрде культивирлеу
Егіс материалын алу барысында көбінесе культивирлеудің кезеңді әдісі қолданылады. Микроорганизмді культивирлеу кезінде компоненттер қоректік ортаға келіп түспей және одан шықпай тұрған кезде микроорганизмдер өсіріледі және көбейеді. Белгілі даму циклы өткен соң, фазаның ауысқаны көрсетіледі, осы жағдайда микроорганизм өседі және көбейеді.
Кезеңдік культивирлеу микробты биосинтез процесімен танысқанда алдымен периодты культураның өсу динамикасын зерттеуден басталады. Периодты культураның дамуы үшін (көп клеткалы организмнің даму циклінің аналогы жоқ) қоректік ортаға егуден басталады. Егу процесі мынадай мөлшерде іске асырылады, минимальды ұстаумен немесе лаг фазасыз микроорганизмнің алдымен өсуімен қамтамасыз етіледі. Биосинтез барысында лаг фазаға түсінікті аз береді немесе өсу үшін қолайсыз жағдайымен түсіндіріледі. Көптеген микробиологиялық процесс үшін ортаның көлемінің 2%-дей мөлшері «жаңадан жасалған» егіс материалына қатысады.
Тізбектелген ауысу фазалары графикалық түрде көрсетілуі мүмкін. Шыны ыдыста (жасушаны өсіруге шыныдан жасалған сосуд ) жасушаның саны егіс материалын еккен кезден бастап анықтаса, әрбір уақыт мерзімі белгіленіп, абсцисса осіне жіберіледі, жасушаның белгілі санына сәйкестеліп ординат осіне жіберіледі (6 сурет).
Бұл қисықты микроорганизмдердің өсу қисығы деп атайды және бірнеше фазаларға немесе периодтарға бөледі.
І фаза лаг-фаза немесе бейімделу фазасы деп аталады.Мұнда жаңадан жасалған қоректік ортаға жіберілген микроорганизмдер көбеймейді, қайта
6 сурет- Периодты культивирлеудегі микроорганизмнің өсу қисығы.
Х-биомассаның саны (1 мл-дегі жасуша саны); τ-уақыт,сағ.;
І-лаг фаза; ІІ-өсуін жылдамдататын фаза;
ІІІ-экспоненциальды фаза; ІҮ-өсуін баяулататын фаза;
Ү-стационарлы фаза; ҮІ-қырылу фазасы;
бейімделеді. Бұл фаза 1-2 сағатқа созылады. Фаза аяқталған кезде жасуша көбейе бастайды.Қоректік ортаны пайдалану қуатты түрде жүреді. Микроорганизмдер көбейгенге дейін қоректік орта инокуляторға енгізіліп отырады. Бұл периодта культура жаңа ортаға бейімделеді, бұл фазаның ұзақтығы микроорганизмдердің физиологиялық ерекшелігіне және культивирлеу жағдайына, байланысты егіс материалына және өндірістік орта құрамына байланысты. Мұндай айырмашылық аз болған сайын және егілетін микроорганизмдердің мөлшері неғұрлым көп болса, онда І фазаның өсуі соғұрлым қысқа болады.
Қандайда бір өзгеріске ұшырауына қарамастан жасуша ішінде бірқатар биохимиялық өзгерістер болады. Жасушада рибосома саны және ақуыз құрамы көбейеді, ферменттік жүйелер активтеледі. Алдымен периодта популяция саны көбеймейді, бірақ жасушаның көлемі ұлғаяды.
ІІ фаза Өсу жылдамдығының фазасы немесе ауыспалы деп аталады. Бұл жасушаның бөліне бастауы болып сипатталады. Бұл сатыда жасушадағы нуклеин қышқылының (ДНҚ, РНҚ) ақуыздың құрамы жоғарылайды, жасушаның көлемі ұлғаяды. Жасуша беті белгілі қатынасы аралық жетістігінің арқасында және оның көлемі жасушаның бөлінуімен жүргізіледі, нәтижесінде культураның өсу жылдамдығы мен популяция саны ұлғая бастайды. Әдетте бұл фазаның жалғасы жоқ.
ІІІ фаза–Жасуша санының анағұрлым активті өсу фазасы. Даму фазасы көбеюдің ең активті фазасы. Онда микроорганизмдер қарқынды дамиды, өсу шапшаңдығы да арта түседі. Бұл екі сағаттай уақытқа созылады. Кейбір жасушалар тіршілігі тежеле бастайды. Ол экспоненциальды немесе логарифмдік фазаның өсуі деп аталады. Бұл фазада жасуша белгіленген өсу жағдайына толығымен бейімделгеннен кейін басталады, культураның өсуі қоректік зат түспесе де, азықтық заттың зат алмасуы мол болмаса да шектелмейді. Өсу жылдамдығы максималдығы бекітіледі. Микроорганизм культурасының өсу процесін меңгеру кезінде абсолютті және меншікті өсу жылдамдығын ажырата білу қажет.
Абсолютті өсу жылдамдығының формуласы мынаған тең:
v
мұнда: х – биомасса саны (г/л) (немесе жасуша саны)
τ – уақыт, (сағ)
Меншікті өсу жылдамдығы биомасса бірлігінің өсу жылдамдығымен сипатталады және мына формула бойынша есептеледі:
,
мұнда: μ-уақыт бірлігіндегі биомассаның өсуі, сағ-1.
Микроорганизмдер культурасының меншікті өсу жылдамдығы болып қандайда бір маңызды сипаты, организмнің өзі және сондай-ақ культивирлеу жағдайы саналады.
Меншікті өсу жылдамдығы мен субстрат концентрациясының арасында, культураның өсуі шектеледі, белгілі байланысы анықталып, Моно теңдеуі түрінде көрсетіледі:
мұндағы: μмакс - максимальді меншікті өсу жылдамдығы;
S – субстрат концентрациясы;
KS – қаныққан констант, меншікті өсу жылдамдығы максималды мәнінің жартысына тең кездегі сандық субстрат конценрациясына тең.
Өсудің меншікті жылдамдығы өнімдерге байланысты болады, жасушалардан зат алмасу процесі кезінде ортаға бөлінеді. Жасушалардың өсуін ингибиторлар тежейтінін ескертетін теңдеу Моно – Иерусалим теңдеуі ретінде белгілі, келесідей түрде келтіріледі:
мұндағы: Р – жасушалардың өсуін ингибирлейтін өнімнің
концентрациясы;
КР – ингибирлеуші констант, өнім концентрациясына саны
тең, бұл кезде өсудің меншікті жылдамдығы екі есеге төмендейді.
Популяцияның экспоненциальды өсу теңдеуі:
х=хo е μ макс τ,
мұндағы: Хо – биомасса саны немесе уақыттың бастапқы кезеңіндегі
жасушалар саны,
е – табиғи логарифмнің негізі.
Бұл теңдеуді логарифмдеуде аламыз:
ln x = lnхо+ μмакс τ
Демек, биомасса мөлшерінің логорифмі және жасушаның саны тұрақты жылдамдықпен жоғарылайды. Сондықтан бұл фаза логарифмдік фаза деп аталады.
Микроорганизмдердің қарқынды өсуінің және қоректік ортадағы микроорганизмдердің көбеюінің нәтижесінде дәл осы қарқындылық пен қоректік заттар жұмсалады да, тіршілік етуші микроорганизмдердің өнімдері жиналады. Сонымен қатар бос кеңістік шектеледі, жасушалар өсу барысында бір–біріне бөгет жасайды, жасушаларға қоректік заттардың келуі және метаболиттердің бөлінуі нашарлайды. Өсу жылдамдығы төмендейді, жасушалардың бөлінуі қысқарып, содан соң өсудің келесі фазасы басталады.
IV фаза – баяу өсу фазасы немесе өсу жылдамдығының төмендеуі. Бұл фазаның, экспоненциальды фазаға қарағанда жасушалар біртекті болмайды, себебі қолайсыз факторлардың әсерінен қоректік зат концентрациясы төмендейді, зат алмасуда өнімнің жиналуы өседі. Мұның барлығы культураның өсу процесінің баяулануына және тоқтап қалуына әкеліп соқтырады, сонымен қатар олардың қырылуына және жасушаларда лизистің тууы мүмкін.
V фаза – стационарлы фаза деп аталады. Стационарлы фазада жаңадан пайда болған жасушалар мен қырылған жасушалардың саны теңеледі. Сондықтан тірі жасушалар саны біраз уақыт тұрақты болып қала береді. Көбею кезінде түзілген өнімдер микроорганизмдердің тіршілігіне нұсқан келтіре бастайды. Бұл фаза бірнеше сағаттан бірнеше күнге дейін созылады. Стационарлы фазада биомасса культурасының өсуі тоқтайды:
Ескере кету керек, бірнеше уақыт бойы бұл фазада биомассаның біршама өсуі болады, бұл стационарлы фазадағы жеке жасушалардың көбеюінің жалғасатынын түсіндіреді. Бірақ көбею процесі жасушалардың жойылу процесімен және олардың кейбіреуінің автолизімен теңеседі.
Биомасса өсуі стационарлы фазаға жеткенде культура биомассасының мол мөлшері және жасушаның максимал саны жиналады. Бұл максимал мөлшерін өнімнің жемісі немесе шығымы деп атайды.
Іс жүзінде сыртқы көзқараспен қарағанда қызығушылық тудырады, бұл экономикалық коэффициент деп аталады. Бұл көрсеткішті пайда болған микроорганизмдердің массасы мен жұмсалған субстрат мөлшерімен салыстыруға болады:
у = х/S .
Стационарлы фаза үшін жасуша популяциясының гетерогенді жоғарылауы сипатталған, онда бірқатар жеке көбейетін жасушамен бірге әлі тірі жасушалар да болады, бірақ олардың әрмен қарай өсу қабілеті жоғалып, лизистенетін өлі жасуша болады.
VI фаза – қырылу фазасы немесе жойылу фазасы. Қырылу фазасында пайда болған жасушалар санынан өлген жасушалар саны басым болады. Қоректік ортаның физикалық-химиялық қасиеті мүлде өзгеріп, микроорганизмдердің тіршілігіне зиянды жағдайға көшеді. Жасушалардың қырылу жылдамдығы арта түседі. Ол өлген жасушалардың саны қайта пайда болған жасушалардың санынан көп болған кезден бастап басталады. Бұл фазада жасушалардың тіршілік ету жағдайлары қолайсыз, ал жасушалардың артық заттарының қоры таусылады.
Микроорганизмдерді периодты әдісте өсіру көптеген өндірістерде, егіс материалын алу сатысында қолданады, оның ең басты сатысы – ферментация, көптеген өндірістер үздіксіз немесе периодты әдіске байланысты емес. Үздіксіз культивирлеудің артықшылығына қарамастан, көптеген өндірістер периодты әдісті қолданады, ол микроорганизмдер продуценттерінің қасиеттерінің қиыншылығына байланысты. Сондықтан популяцияның даму сатысын білу, барлық технологиялық процестің жақсы өтуі үшін жоғарғы мәнге ие болады.
Микроорганизмдерді үздіксіз культивирлеу
Периодты культивилеуде микроорганизмдердің барынша максималды өсу қабілеті толық қолданылмайды. Тіршілік етудің ең белсенді кезеңі – логарифмдік фаза - өндірістік циклдің азырақ бөлігін алады, ал уақыттың көп бөлігі лаг фазаға кетеді және өсудің жәймен өсетін кезеңіне өтеді.
Периодты культивирлеу кезінде жасушалар барлық уақыт бойы ауыспалы жағдайда болады. Алдымен қоректік ортаға дер кезінде мол мөлшерде қоректік заттарды енгізсе, жасуша өсуінің ингибирленуі сонда тіршілік етуші микроорганизм өнімнің жиналуы және қоректенудің жетіспеуі басталады. Егер қоректік ортаға бірден мол мөлшерде қоректік зат қосса, онда культураның өсуінің ингибирленуі болады, демек микро-организмдердің катаболиттік репрессиясы деп аталады. Қоректік затты жәймен қосудың арқасында микроорганизмдердің өсуінің ингибирленуінен құтылуға болады. Осындай мөлшерде қоректік заттарды енгізу процесі кезінде микроорганизмдердің өсуінің ингибирлеруін болдырмауға болады. Бұл әдіс субстратты аздап мөлшерлеумен микроорганизмдерді культивирлеу деп аталады.
Культивирлеу барысында қоректік көздерін қосу кезінде қоректік ортаның көлемі өзгереді. Орта көлемін қалыпты және ортадағы тіршілік етуші микроорганизм өнімдерінің концентрациясын төмендетіп ұстап тұру үшін, культуральды сұйықтықтың бір бөлігін белглі бір уақыт аралы-ғында аппараттан алып тастауға болады. Мұндай периодты культивирлеу процесті «көлемді-мөлшерлеуіш» деп атайды. Мұның алдыңғы әдістен айырмашылығы, культураның бөлігі периодты түрде жаңа ортаға түскен сайын алынып тасталып отырады. Берілген жағдайда процестің негізгі параметрлері – көлемі, араластыру жылдамдығы, өсудің меншікті жылдамдығы – тұрақты болып есептелмейді культура квазистационарлы (мнимостационарлы) жағдайда болады.
Субстратты аздап мөлшерлеуде периодты культивирлеудің тағы бір әдісі бұл – диализдеуші мембрана арқылы лимиттеуші субстраттың келуін бақылаушы процесс. Егер аппаратқа мембрана орнатқанда, сол арқылы тек белгілі бір заттар ғана енеді, мембранадан бөлінген, ерітіндіден еріген зат диффузиясы арқасында ортадағы оның концентрациясы тұрақты ұсталынып тұрады. Бұл әдісті шектелген субстрат продуцентінің өсуі үшін қолдануға болады немесе биомассаны концентрлеу үшін, субстратты аздап мөлшерлеуіш периодты культивирлеу үшін, даму фазасынан популяцияға келу уақытының көбейтуіне мүмкіндік береді. Бірақ жасушалардың физиологиялық күйін тұрақтандыруды уақытқа байланыстырмай осы әдіспен жүзеге асыру мүмкін емес.
Микроорганизмдерді үздіксіз культивирлеу жағдайлары
Үздіксіз культивирлеу, экспоненциалды даму фазасында микроорганизмдердің тіршілік етуін ұстап тұру үшін ферментерге белгілі мөлшерде және сапалы қатынаста қоректік заттарды үздіксіз беріп отыру болып табылады. Мұндай жағдайларда қозғалмалы күйден тепе – тең күйге жеткізеді, бұл кезде жасушалардың үздіксіз жағдайда және бірдей жылдамдықпен көбеюі, қоректік заттардың келіп түсу жылдамдығымен сәйкес болады. Культивирленетін жасушалар қоректік заттар мен үнемі қамтамасыз етуіне қарамастан культуральды сұйықтықта іс жүзінде олар мүлдем жоқ, демек ағып өтетін сұйықтықта жоқ деген сөз.
Үздіксіз культивирлеудің аса маңызды сипаттамасының бірі ол араластыру жылдамдығы, демек ферментердегі қоректік ортаның алмасу жылдамдығы. Егер культиватордың көлемін (V/л), ал ортаға келу жылдамдығы – ағын жылдамдығы F(л/сағ) деп белгілесек, онда араластыру жылдамдығы D(сағ-1) тең болады:
D=F/V
Микроорганизмдердің өсуінің меншікті жылдамдығы:
Осыдан культивирлеу кезіндегі микроорганизмдердің тез өсуі мынаған тең:
Үздіксіз культивирлеу жағдайында биомассаның тез арада өсуі μх, оның орта мен Dх, кетуімен қамтамасыз етіледі,яғни μх – Dх =0 немесе (μ-D)х=0
Осыдан: μ= D
Бұл теңдеу микроорганизмдерді үздіксіз культивирлеу кезінде орныққан тепе-теңдікті ұстап тұрудың негізгі шарты. Бұл кезде барлық технологиялық және физиологиялық көрсеткіштер тұрақты болып сақталады. Технологиялық көрсеткіштерге культуральды сұйықтық компоненттерінің концентрациясы, ал физиологиялық – жасушаның өсу жылдамдығы және олардың құрылымдық -биохимиялық ерекшеліктері жатады.
