53 Сурет - Кобирин қышқылы

В₁₂ витамині аздап болса да микроорганизмдердің қатысуымен ішекте түзілуі мүмкін. Микробтардың синтезі арқылы түзілетін В₁₂ витаминінің алыну жолы ең арзаны болып саналады. Цианокобаламин өсімдік тағамдарында аз, ал ет, сүт, жұмыртқа және балық тағамдарында көбірек кездеседі. Осы тағамдарды аз пайдаланса, бұл витаминінің жетіспеушілігінің байқалуы мүмкін.

В₁₂ витаминінің адам организміне қажет мөлшері осы уақытқа дейін толық анықтала қойған жоқ, бірақ шамамен тәулігіне 5 -10 мкг шамасында қажет болуы керек. Корриноид жүйесі.

Цианкобаламин порфирин құрылымына енетін корриноид класына жатады. Бірақ олардың құрылымы жақын болғанымен екі маңызды химиялық айырмашылық бұл екеуінің макроцикласында көрінеді. Порфирин 12 қос байланысты құрайды, ал коррин гетероцикл арқылы құрылады. Корриндік байланыс 6 қос байланыстан, яғни макроциклдің ішкі контурын құрайтын 15 атомның 12-сін құрайтын байланыстан тұрады. Корриноид сақинасы порфиринмен салыстырғанда кең тараған. Егер порфириндегі әрбір жұптық перрольдық сақина метилдік көпірлермен бөлінсе, кориндік сақинада амин арқылы байланысқан. Сондықтан да корриндік макроциклдің ішкі контуры көміртегі атомын парфирионды сақинадан аз қабылдайды. Кобальт атомы арқылы құрылған 4 перрольді сақина 1975 жылы биологиялық химия номенклатурасы халықаралық келісімімен коррин деп аталған. Ал оның құрамына енетін заттар корриноидтар деп аталады.

Карбоксил қышқылдар тобы а-g әріптерімен белгіленген. a, b, с, d, o, g- гексамид кобириндік қышқылдар деп аталады. Кобириндік қышқылдардың d-1 амино пропанол-2, екінші жағдайда f-амид болып табылады. Оның гексоамиді кобинамид деп аталады. 5-6-диметилбензол-мидазольды лиганд, яғни N-1 және С-1 рибофураны арқылы құрылған кобамид кобаламин деп аталады. Ал а жағдайындағы 5-6-диметилбензимодозол кобаламид деп аталады.

Кобаламин

ΧІΧ – ғасырдың ортасында асқазанның сілекей қабаттарының дертке шалдығатындығы мен қанда мөлшері жағынан едәуір жетілмеген қызыл қан түйіршіктері шамадан тыс кездесетіндігі туралы факт анықталып, бұл ауруды пернициозды анимия деп атады. Мұны жұқпалы аурулар қатарына жатқызып, ұзақ уақытқа дейін емдеу тәсілі табылмады. 1926 жылы осы қатерлі қан азаюына қарсы адамдарға шикі бауырды бергенде, оның қан құрамын жақсартуға пайдасы тигендігі байқалды. 1948 жылы бауырдан құрылысы жағынан қан геминіне ұқсас, құрамында кобальт бар, жаңа витамин кристалл түрінде бөлініп алынды. Мұның құрамы жағынан өте күрделі қосылыс В₁₂ витамині немесе цианокобаламин болатын. Ол дені сау адамның асқазан сөлінде кездесетін құрамында 11-12% гексамині бар, мукопротеин ақуызы екен.

Кобаламиндегі кобальтті ашу. Кобаламинді калий бисульфатымен бірге балқытады, кобаламин бұзылады да, ондағы кобальт α – нитрозо – β – нафтол немесе α – нитрозо – дисульфо - β – нафтол реакциясымен қызыл түсті комплексті тұз түзу арқылы анықталады. Бұл реакция нәтижелі болу үшін сірке қышқылды натрий қосады, себебі күшті қышқылдық орта комплекс түзілуіне кедергі жасайды.

В витаминдер тобының пантотен қышқылына, биотин мен В₆ витамині.

Пантотен қышқылы липид пен амин қышқылының алмасуында маңызы зор болатын ферменттердің құрамына кіреді. Пантотен қышқылының жетіспеуі өте сирек болады. Ол бейжай тартып, бұлшық еттердің шаншуынан, башпайлардың ұюынан байқалады.

Биотин (Н витамині) амин қышқылдары мен май қышқылдарының алмасуын реттейтін ферменттердің құрамына кіреді. Биотин жетіспеген жағдайда қол, аяқ және бет дерматиті шығады, жүйке жүйесінің қызметі бұзылады. Биотин бәрінен гөрі бауыр мен бүйректе (80-140 мкг/%) , сояда (60 мкг/%) көп, көкөніс пен жемістердің көпшілігінде оның мөлшері 0,1-2 мкг/% болады.

В₆ витамині амин қышқылдары мен май қышқылдарының алмасуына қатысатын ферменттердің құрамына кіреді. Ересек адам тәулігіне оның 2 миллиграмын қажет етеді.

В₆ витамині жетіспеген кезде жүйке жүйесінің қызметі бұзылып, дерматиттер пайда болады.

Жан басына шаққанда бізде орта есеппен тәулігіне В₆ витамині 2,4 миллиграммнан келеді. Бұл нормаға (миллиграмм) жақын.

В₁₂ витаминінің биосинтезі

В₁₂ витаминінің продуценті

Витаминдер деп - барлық тағамның құрамында кездесетін төменгі молекулалы органикалық заттар аталады. Витаминдер өте төмен концентрацияда болса да, организмге өте үлкен биологиялық әсерін тигізеді.Табиғата витаминдер көзі болып микроорганизмдер және өсімдіктер, жануарлар болып саналады.Менахинондар және кобаламиндер микроорганизммен синтезделеді. Химиялық синтезбен алынатын витаминдердің үлкен бөлігі жоғарғы мәнге ие, сонымен қатар іс жүзінде микробиологиялық әдістің де үлкен мәні бар.

В₁₂ витамині және туыстасы корриноид қосылыстары микроорганизмдер клеткаларында, жануарлар ұлпаларында және кейбір жоғары сатылы өсімдіктерде болады. Бірақ В₁₂ витаминінің жоғары сатыдағы өсімдіктерде болатындығы толығымен анықталмаған. Корриноидтар мицелиалы саңырауқұлақтар мен ашытқылар сияқты төменгі эукариодтарды құрайтын көрінеді. Жануарлар организмі витамин синтезін өз бетінше жүргізе алмайды. Прокариоттар арасында корриноидтар биосинтезін жүргізе алу қабілеті кең таралған. Propioni bacterium туысының өкілдері В₁₂ витаминін өндіреді. Табиғаттағы пропион қышқылды бактерия штамдары корриноидтардың 1,0 -8,5 мг/л құрайды, бірақ витамин 57 мг/л -ге дейін алынатын Р.Shermanii М–82 мутанты алынған.

Propioni bacterium туыстасының ішіндегі клеткасында В₁₂ витаминін мол жинақтауға қабілетті басқа да өкілдері бар. Бұл алдымен Eubacterium limosum туыстастары микроорганизмдер мен көп актиномицеттің өкілдері витамин продуценттері ретінде практикалық жағынан қызығушылық тудыруда.

Нағыз В₁₂ витаминін жоғары көлемде Nocardia rugosa синтездейді. Мутация және таңдау арқылы В₁₂ витаминін 18мг/л -ге дейін жинақтайтын N. Rugoza штаммы алынған, оның туыстас өкілдерінің арасында витаминнің белсенді продуценттері табылған. Метаногенді бактерияларда жоғарғы кобаламин синтезіне белсенділігі анықталады, мысалы Methanosarcina bacter, vacuolata және галофильды түрдің кейбір штамдары Methanococcus halophilus. Соңғы кездері организмде 1 грамм биомассада 16 мг корриноидқа дейін синтездейді. Микроорганизмдердің ешқайсысында құрамы жоғары корриноидтардың жинақталуы анықталмаған. Метаногенді бактерияларда корриноидтардың жоғары жинақталу себебі анықталмаған. Корриноидтарды анаэробты бактериялардың ішіндегі клостридан туыстары синтездейді. Y.Clostridium teranomorphum и Cl. Sticrlandii аденозилкобаламиндері орнитин, лизин және глутамин сияқты амин қышқылдарының изомеризациясының арнайы реакцияларын катализдейтін ферменттік жүйе құрамына кіреді. СО₂ -ден ацетатты синтездейтін Cl. Thermoaceticum, Cl. Formicoaceticum және Acetobacter woodi ацетогенді клостридиндер В₁₂ витаминінің жоғарғы көлемін құрайды.

Псевдоманадтарда В₁₂ витаминін белсенді өндіретін өкілдері белгілі, олардың ішінде Pseudomonas denitrificans штаммы басқалардан гөрі көп зерттелген.

В₁₂ витаминінің көлемді санын цианобактериялар Anabaena cylindrica, бір жасушалы Chlorella pyrenoidosae атты жасыл балдырлар және Rhodosorus marinus атты қызыл балдырлар құрайды.

В₁₂ витамин продуценттерін балық ұны, жүгері және ет қайнатпасы, соя ұны сияқты тағамдар негізінде дайындалған қоректік орталарда өсіреді.Соңғы жылдары корриноидтардың сапасын жоғарылататын микроорганизмдер анықталған, Achromobacter sp.олар, изопропильді спирті мен энергия көзі ретінде көміртегі қолданылып, провитаминді 1,1 мг/л дейін жинақтайды. Энергия мен көміртегінің жалғыз ғана көзі ретінде метанолмен ортада өсетін жасушаларда корриноидтардың көп санын құрайтын Klebsiella 101 штамы алынған.

В₁₂ витаминінің(цианкобаламин) биосинтезі

Витамин молекуласының әр белгіленген құрылымының корриноидты шеңбері, нуклеотидті ядросы және амин пропаноиды көпірі, өзінің шыққан тегі бар. Олардың пайда болу механизмі –бұл қарқынды бірақ әлі бітпеген ізденістер қажет. Корриноидтар биогенездің алғашқы сатылары тетрапирольды қосылыстар синтезінің алғашқы сатысындай.

Тетрапиррольдардың жалпы интермедиаты δ – аминоловулинді қышқыл болып табылады, (δ – ААК) ол көпшілік организмдерде сукцинил КоА мен глицин конденсациясы нәтижесінде пайда болады. Бірақ корриноидты шеңберге 2 -14 С глицинді E. limosum және C.tetanomorphum қоспайды.

Сонымен бактерияларда витаминді синтездеу жолы осы сатыда ажыратылуы мүмкін. Әрі қарай δ – ААК 2 молекуласының конденсациясы - кезінде порфобилиноген, ал порфилиноген 4 молекуласының конденсациясында -уропордириноген пайда болады. Қазіргі кезде коррифирин -1, метилкоррифирин коррифирин -2 немесе сирогидрохлорин (диметилкоррифирин) және коррифирин -3 немесе изобактериохлорин ( триметилкорриферин) атты үш қосылыстармен сипатталып бөлінген.

Белгіленген δ –ААК және метионин коррифириндерге, ал соңғылары В₁₂ витаминіне енеді.

УПГ ІІІ метилирлеуі С шеңбері С₁₂ сірке қышқылының шеткі тізбегі декарбоксилирленуімен бірге басқа тетрапиролдардың және В₁₂ витаминінің биогенез жолдарының ажырауына әкеп соғады.

54 сурет - Биосинтез жолында В₁₂ витаминінің корриноидты құрылысы

А мен Д шеңберлер арасында С – С байланыстарының пайда болуы мен метилдеу нәтижесінде кобиринді қышқылы синтезделеді. S – аденозилметионин УПГ ІІІ-ке енетін жеті метил топтарының доноры болып табылады. А мен Д шеңберлерінің арасындағы байланыстың пайда болуы және Со атомы қосылу сипаты белгісіз.

Биосинтез жолының келесі сатысында кобирин қышқылы кобинамидке айналады (В фактор), мұнда кобирин қышқылын карбон қышқыл қалдықтары аминопротенолға қосылады.

Бұл сатыда 5 – дезоксиаденозил тобына корринді шеңбердің қосылуы өтеді және корринді қышқыл 5 – дезоксиаденозилкобинамидке айналады (фактор В коферментті түрі). Аминопропонол L – треонин декарбоксильдеу кезінде пайда болады.

Әрмен қарай кобинамидфосфат пайда болуымен кобинамид фосфорилденеді және гуанозинтрифосфатпен (ГТФ) байланысып кобинамид – гуанозиндифосфатты құрайды. Кобинамид гуанозиндифосфат коферментті түрінде нуклеотидке қосылып, кобаламин 5 –фосфат пайда болады. В₁₂ витамині, жоғарыда аталғандай, табиғатта тек қана осы қосылыс түрінде кездесетін 5,6 –ДМБ азотты негізді құрайды. Рибофлавин 5,6 –ДМБ алдындағы өкілі болып келеді. В₁₂ витамин молекуласына 5,6 –ДМБ α – рибазол – 5 – фосфат түрінде қосылады. Кобаламин – 5 – фосфат ферментативті дефосфорилдеу кезінде кобаламин пайда болады. Кобаламин синтезі арқылы кобинамид алу келесі реакциялар арқылы жүреді:

1. кобинамид + АТФ → кобинамид – Ф + АДФ;

2. кобинамид – Ф + ГТФ → ГДФ –кобинамид + ФФ_и;

3. кобинамид – ГДФ + α – рибазол – 5¹ – фосфат → кобаламин – 5¹– фосфат + ГМФ;

4. кобаламин – 5¹ – фосфат → кобаламин + Ф_и.

В₁₂ витаминінің 2 коферментті түрі белгілі: аденозилкобаламин (І коферментті түрі) және метилкобаламин (ІІ коферментті түрі). 80% астам пропион қышқыл бактерияларымен синтезделген корриноидтар 1 коферментті түрге жатады.

АТФ аденозил көзі болып табылады. Коферментті түрі Со–С байланыс түрінен тұрады және бірінші кобальт органикалық қосылыс болып табылады. Метилкобаламин клетка құрамында кездеседі, бірақ 5–оксибензимидазол нуклеотид бөлігінен тұратын xareri метил – фактор ІІІ.барлық кариноидтар сомасынан 80% құрайды. В₁₂ витаминінің биосинтезін реттеу репрессия принципі арқылы жүреді. В₁₂ витамині өзінің синтезін ғана басады, басқа тетрапироллдың пайда болуына әсерін тигізбейді.

Витаминнің функциональды түрі болып аденозинкобаламин α ( 5,6 – диметилбензимидазолил) – Со – 5 дезоксиаденозинкобамид және метилкобаламин (α 5,6 –диметилбензимидазолил – Со – метилкобамид) болып табылады.

В₁₂ витаминін алу және оның қолданылуы

В₁₂ витаминінің әлемдік өнімділігі жылына 9 -11 мың кг құрайды; оның ішінде 6500 кг медициналық мақсатқа, ал қалған бөлігін мал шаруашылығында қолданады.

В₁₂ витамин өндірісі пропион қышқыл бактериялары (Кеңес үкіметінде, Ұлыбританияда, Венгрияда), мезофильді және термофильді бактериялар, актиномицеттер мен оның туыстас түрлерімен өндіру негізделген (Италия).

Біздің мемлекетте В₁₂ витаминнің продуценттері ретінде Propionibacterium freudenreichii var. Shermanii қолданылады.

В₁₂ витаминін алу мақсатында аммоний сульфаты және кобальт тұзы, глюкоза, жүгері қайнатпасынан тұратын қоректік ортада, анаэробты жағдайда периодты әдіспен бактерияларды өсіреді. Ашу кезінде пайда болатын қышқылдарды сілтілі қоспасымен бейтараптайды, олар ферментерге барып тұрады. 72 сағаттан кейін ортаға 5,6 – ДМБ қосады.

Клиникалық мәні жоқ псевдовитамин В₁₂ және В факторын 5,6 –ДМБ қоспасымен бактериялар синтездейді.

Ферментация процесі 72 сағаттан соң аяқталады. В₁₂ витамині бактериялар жасушасында сақталады. Сондықтан ашу процесі аяқталғаннан кейін биомассаны тазалап және стабилизатор ретінде 0,25 % NaNО₂ қоспасымен 60 минут ішінде 85 – 90°C температурада витаминді рН 4,5 -5 дейін қышқылданған сумен экстракциялайды. Ко– В₁₂ алуда стабилизаторын қоспайды.

В₁₂ витаминді 50% су қосылған NаОН 6,8 -7,0 рН дейін жеткізіп суытады. Ерітіндіге Al₂(SO₄)₃ ·18Н₂О және ақуыз коогуляциясы үшін сусыз FeCl₃ қосып, фильтр –пресс арқылы фильтрлейді.

Ерітіндіні тазартуды аммиак ерітіндісімен элюирлейтін кобаламиндер арқылы СГ-1 ион алмасу смоласымен жүргізіледі. Әрмен қарай Al₂О₃ мен бағанада тазалау, булау және органикалық ерітінділер және витаминді сулы ерітіндісімен қосымша тазалайды. Аммоний қышқылдығынан кобаламиндерді сулы ацетонмен элюирлейды. Сонымен қатар Ко– В₁₂ оксикобаламин мен СN-тан бөлінуі мүмкін.

Витаминнің сулы –ацетонды ерітіндісіне ацетонды қосып 3-4°C 24 -48 сағат ұстайды. Түсетін витамин кристалдарын тазартып, құрғақ ацетонмен және эфирмен жуып, вакуум эксикаторда Р₂О₅ үстіне қойып құрғатады.

Ко – В₁₂ витаминнің бұзылмауы үшін барлық операциялар қараңғы бөлмеде немесе қызыл жарықта жүргізілуі қажет.Сонымен, оксикобаламин және СN қоспаның тек өзі ғана емес, оның жоғары терапевтикалық эффектісін меңгеретін коферментті түрін алуға болады.

В₁₂ витаминін химиялық тазалау үшін резорцин мен фенолдың мүмкіндігі қолданылады. Бұл әдісте В₁₂ витаминін бөлу ықшамдалады. Өндірістік цианкобаламин концентратын резорцин су ерітіндісімен өңдеп алып, В₁₂ витаминінің резорцин комплексін бөліп алады, әрмен қарай оны ыдыратып кристалл түріндегі препаратын алады.

Кеңес Одағы кезіндегі өндіріс кобаламиннің емдік препараттарының әр түрлі түрлерін шығарады: 0,9% NaCl ерітіндісінде дайындалған СN–В₁₂ ерітіндісінің залалсыздалған ампулалары, фоли қышқылының қоспасындағы СN – В₁₂ түймедақ тәрізді түрлері, мукопротеид және СN – В₁₂ құрайтын дәрілер.Ампуладағы дәрілік препараттар: камполон, антианемин және гепавит – олар ірі қара малдың бауырының сулы экстрактын құрайды.

Пропион қышқылының бактериясы мутагенезді перспективті зерттеулердің әдісі өнім штамының өнімділігін жоғарылатады, сонымен қатар арзан шикізатта өсіріп өндіріске енгізілді.

В₁₂ витаминін Кеңес Одағы кезінде пропион қышқыл бактериялар арқылы өндірісте алу мемлекетіміздің медицина саласының қажеттерін толық қанағаттандырды.

Сүт қышқылды өнімдерді В₁₂ витаминімен байыту үшін пропион қышқыл бактерияларды таза және сүттің сары суын дайындағанда концентрат түрінде қолданды. Мал шаруашылығы үшін термофильді метан түзетін бактериялары бар, аралас культураларды қолданып В₁₂ витаминін алды. Корриноидтардың пайда болуы тек аралас емес, сонымен қатар таза СО₂ мен Н₂ қатысуымен метан түзетін бактериялардың культураларында анықталған. Метан түзетін бактерияларда корриноидтардың құрамы құрғақ биомассаның 1,0 -6,5 мг/г құрайды.

Кеңес Одағы кезінде метан түзетін бактериялардың аралас культуралары арқылы В₁₂ –КМБ₁₂ витаминін алу әдісі өңделген. Метан ашуда субстрат ретінде ацетон –бутил және спирт бардасы қолданылады.

Ацетон – бутил бардасын ұнды заторларды ашытатын Clostridium acetobutulicum-нің культуральдық сұйықтықтан ерітіндіні шығару нәтижесінде алады. Метанды ашытуға құрғақ затты 2,0 -2,5% барда декантатын қолданады. Декантатты бардаға кобаламин синтезінің стимуляторлары ретінде метанолдың 0,5 % және CoCl₂ 4г/м³ қосады. Биостимуляторлар ретінде диаммоний фосфат және карбамид қосады, 5,6 –ДМБ қоспайды, өйткені СN – В₁₂ және ІІІ факторы корриноидтардың барлық санының 80% құрап, биологиялық белсенді бола алады.

Бастапқы барданың температурасы 100°C және ол залалсыздалған таза. Ферментерге түсер алдында барда 55 -57°C температураға дейін суытылады. Бастапқы культура ретінде ағын судың термофильді «метин ашуын» жүргізетін метан түзетін бактериялардың аралас культурасын қолданады.

Келесі технологиялық сатылар арқылы В₁₂ витамин концентратын алуға болады: бактериялар комплексімен барданы ашыту, метан ашуын қоюлатуда массаны шашыратқыш кептіргіште кептіреді. Ашытуды үздіксіз темір бетонды ферментерде жыл бойы жүргізеді. Ашу процесінің маңызды жағдайлары - ол аммоний азотының және май қышқылдарының деңгейін қадағалау.

В₁₂ витамині жылумен өңдеуге шыдамайды, әсіресе сілтілі ортада. Сондықтан булау алдында метан ашытқысына Nа сульфитін және рН 5,0 -5,3 қолайлы ету жағдайда НCl қосады (оптимальды құрамы 0,07 -0,1%). Булау процесінің алдында метан ашытқысы атмосфералық қысымның арқасында 90 -95°C температурада қыздыру арқылы деградацияға ұшырайды. Ашытқыны құрғақ заттың құрамы 20% дейін қоюлатады. Қою метан ашытқысы кептіргіште кептіріледі.

Бұл әдістің экономикалық жағынан тиімді екендігін өндіріс қалдығының жоқтығы, қолданылатын шикізаттың көптігі, залалсыздалған жағдайдың қажет еместігі көрсетеді.

Кеңес Одағы кезінде В₁₂ витаминін Грознен ацетон және Ефрем биохимиялық зауыттарында алынған.