Бақылау сұрақтар

1. Микробиологияда синтезде инактивтелген биомасса ретінде болатын биопрепаратты атаңыз?

2. Білікті кептіргіштердің қолданылатын аумағы және кемшіліктері?

3. Культуральды сұйықтықтан дайын өнімді алуда қандай әдіс қолданылады?

4. Культуральды сұйықтықтан дайын өнімді ион алмасу әдісімен бөліп алу неге негізделген?

5. Культуральды сұйықтықтан биологиялық активті затты ион алмасумен бөліп алуда динамикалық әдіс нені қорытындылайды?

Тест сұрақтар

1. Ферментерден шыққан ауаны:

А) Залалсыздану керек;

В) Ішінде оттегі көп;

С) Тек қана өлі микроорганизмдер болады;

D) Екінші рет қайталап тазалаусыз қолдануға болады;

Е) Атмосфераға шығаруға болады;

2.Технологиялық сызба нұсқадағы беттік культивирлеуде болмайтын қондырғы:

А) биореактор;

В) өсімдік камерасы;

С) кюветалар;

Д) залалсыздардырғыш;

Е) дұрыс жауап жоқ.;

6 - сабақ. Микроорганизмдер селекциясы

Сабақ жүргізу формасы: лекция – консультация

Лекция «Сұрақ-жауап-дискуссия» түрі бойынша жүреді және негізгі үш бөлімнен тұрады.

• Лектордың жаңа оқу ақпаратын түсіндіру

• Сұрақ қою

• Қойылған сұрақтарға жауап іздеуде дискуссия ұйымдастыру

Жаңа ақпаратты құрудың жоспары:

1.Селекция процесінің теориялық негіздері

2.Селекция үшін бастапқы микроорганизмдерді таңдау

3.Селекциялық жұмысқа селекциялық материалды дайындау

4.Мутанттар алу

5.Оң мутанттарды таңдау

Дискуссияны ұйымдастыру және сұрақты қою кезінде студенттер өздерін еркін ұстап студенттердің дайындалу дәрежесіне қарай экспортпен ұйымдастырылады. Дискуссияны жүргізуге арналған сұрақтардың тізімі лекцияның соңында келтірілген.

Теориялық негіздері

Өндірістік маңызды зат микроорганизмдердің тіршілік етуі бойынша, табиғатына және микроб клеткасының маңыздылығына байланысты негізгі үш топқа бөледі:

1. ірі молекулалар (ферменттер, полисахаридтер молекулалық массасы он мыңнан бірнеше милионға дейін)

2. біріншілік метаболиттер (микроорганизмнің өсуіне қажет қосылыстар: амин қышқылдары, пурин және пиримидин нуклеотидтер, витаминдер т.б.)

3. екіншілік метаболиттер (микроорганизмдердің өсуіне қажетсіз қосылыстар: антибиотиктер, токсиндер, алкалоидтар, өсімдіктің өсу факторлары).Біріншілік және екіншілік метаболиттер микроб типті болса да ферменттермен салыстырғанда молекулалық массасы- 1,5 мыңға төмен болады.

Бұл заттар биологиялық активтілігін әр түрлі көрсетеді: адамдар мен жануарлардың қолданылуын қанағаттандырады, микроорганизмдермен, жәндіктермен, өсімдіктермен әрекет етеді, әртүрлі органикалық субстраттарда көбеюге қатысады. Сонымен қатар, кейбір амин қышқылдары химиялық синтез негізінде әрмен қарай дамуға шикізат болып табылады.

Өнеркәсіптік өндірістің рентабельді объектісі болу үшін, микробтық синтез өнімі, қоректік ортаға микробтық клеткамен бөлінуі керек және мол мөлшерде ортада жиналады. Олар әрмен қарай культивирлеуге қолдануға жарамды болу керек.

Көп жағдайда микробиологиялық әдісті таңдау заттарды алу басқа әдістермен алуға болмайды, бірінші орында химиялық синтездеу жолымен.

Көптеген антибиотиктер, ферменттер, биологиялық активті заттар амин қышқылдары қатарының изомері, пурин нуклеотидтер,токсиндер, өсімдіктің өсуін реттейтін факторларын қазіргі кезде микроорганизмдердің көмегімен алуда, ол әрі оңай, әрі тиімді және оған арзан шикізат көзі қолданылады, бұл көп сатылы химиялық синтез жасағанға қарағанда немесе ферментативті синтездеудің бір-екі сатысын жүргізгеннен тиімді, ол үшін күрделі әрі сирек кездесетін шикізатты қолдануға тура келеді.

Бірақ, микроорганизмдердің табиғи штамдары қажет өнімдерді қоректік ортада бөліп алып, жинай алмайды, демек ол халық шаруашылығына қажет өнімді, арзан шикізатпен қамтамасыз ете алмайды. Микроорганизмдердің кейбір топтарының табиғи штамдары (жетілмеген саңырауқұлақтар, актиномицеттер, бациллалар) қоршаған ортаға салыстырмалы аз мөлшерде антибиотиктерді, токсиндерді немесе гидролитикалық ферменттерді бөледі. Біріншілік метаболиттер, микроорганизмдермен қажет мөлшерде бөлінбейді (бұл заттардың синтезделу мөлшері қатаң шектелген және клетканың өзінің пайдалануына ғана есептелген). Бұл заңдылыққа бағынбайтын – табиғи штамдармен глутамин қышқылының бөлінуі (глутамат продуцирлейтін түйнек бактерияларының тобы) бәсеңдететін көптеген басқа аминқышқылы таратылмайды.

Осыған байланысты селекционерлердің мақсаты –микроорганизмдердің табиғи қабілетін белгілі заттардың (антибиотик, фермент, токсинді затар және т.б.) продуцирлеуге арттыру ғана емес басқа жағдайда да жабайы типтегі штамнан «қайта» продуцент алу, ол заттар синтезделуге қабілетті болуы керек, бірақ оны (мысалы, амин қышқылын) продуцирлеу қабілеті жоқ.Бұл жұмыстар табиғи штамдардан тұқым қуалаумен мутациялар алу жүзеге асырылады, олар микроорганизмнің табиғи синтезделу және продуцирлеу қабілетін күшейтеді, сонымен қатар жаңа қабілетінің дамуы – заттарды мол мөлшерде синтездеу - өз қолдануынан жоғары деңгейде және оны продуцирлеу қабілеті артады.

Микроорганизмдергі бір не басқа заттың өнім деңгейін әрмен қарай арттыру – селекционерлердің тұрақты мақсаты болып табылады, себебі қосымша қаржы салуды талап етпейтін микробиологиялық өндірістің интенсификациялау әдісінің ең тиімдісі өнімділігі жоғары штамды қолдану болып табылады.

Біріншілік немесе екіншілік метаболиттердің микроорганизмдермен синтезделуін субстрат клеткасын (көміртегі, азот көзі, микроэлементтер) жұтылудан басталатын процесс түрінде елестетуге болады және одан соң әр түрлі ферменттердің көмегімен катализденетін бірнеше сатылардан өтетін бір бөлігі қатты заттың немесе оның жеке сатыларында аралық заттардың синтезін реттеуге жұмсалады.

Қажет заттың бастамалары аралық не соңғы өнімі болуы мүмкін, олар синтездеудің басқа жолдарына, өзігінен реттеушілердің шығындалуына, клетканың басқа қажеттіліктеріне жұмсалуы мүмкін. Сонымен қатар, продуцирлеуші зат ферменттің әсерінен деградацияға ұшырамай культивирлеу ортасында жиналуы керек, оны микробтық клетка синтездеуі мүмкін.

Өнімнің жоғарғы деңгейде синтезделу қабілетіне теориялық жағынан мутациялар, структуралық гендердің мол мөлшерін бұзуы мүмкін, олар синтездің барлық сатысында ферменттерді кодирлеуші берілген өнімнің катаболизмін реттейді, сонымен қатар генді реттеуші болып табылады.

Мұндай мутациялардың нәтижесі клетка метаболизмінің әр түрлі өзгерістерінде көрінуі мүмкін:

- клетканың субстратты жұту және утилизациялау жылдамдығының жоғарылауы;

- биосинтетикалық фементтердің синтез деңгейінің жоғарылауы немесе олардың активтілігі, синтездің негативті бақылауының бұзылу есебінен және өнімді синтездеу жолында ретеуші ферменттердің активтілігі;

-синтездің жағымсыз реакцияларын болдырмау, ол басқа метаболиттердің синтезіне шығынды азайту үшін қажет;

• басқа метаболиттердің синтезіндегі жалпы предшественниктердің шығынын төмендету үшін синтездің қосымша реакциясын блокирлеу;

• блокирлеудің әрмен қарай клетка сыртындағы өзгерген өнімі, егер ол солай болса;

• клеткадан өнімді эффективті экскреция жасауды қамтамасыз ету;

• өнімнің деградациясын блокирлеу;

• өнімнің синтезінің реттелуінің позитивті формаларын күшейту.

Егер қажетті өнім клеткадан бөлінетін фермент болса (көбінесе ол гидролитикалық ферменттер соңғы кезде қызығушылық тудырады және оксидоредуктаза қатарына, аминқышқылы катаболизміне қатысатын) оның түзілуіне әсер ететін және активтілігіне әсер ететін мутациялар және де ортада жиналуын қамтамасыз етеді:

-структуралық ген, мутантты фермент синтезіне әкеліп, ол соңғы өнім реакциясының ингибирленуін сезбейді және оның активтілігін арттырып (айналу саны демек, минуттағы өзгерген субстраттың мол саны), геннің промоторлы бөлігіндегі мутация фермент синтезінің транскрипциясының инициациясының жиілігін арттыруы керек;

-ақуызды кодирлеуші гендер, берілген ферменттің синтезін реттеуге

қатысушылар (катаболитті репрессия типі бойынша әртүрлі формада болатын және клетканың өсу жылдамдығына байланысты жалпы түрде көрсететін катабольт сезетін фермент синтезіне кері байланыста) фермент синтезін шектейтін, бұл гендегі мутация факторларды жояды немесе шығарып тастайды;

- клеткалық мембрана компоненттерін синтездеуге жауапты, гендер ол «жинауға» қатысады (эукариоттарда) және фермент экскрецияға қатысады, бұл гендердегі мутациялар көрсетілген процестердің эффективтілігін арттыруы мүмкін;

гендер, кодирлеуші ферменттер, қажет ферментті гидролиздеуі және инактивирлеуі мүмкін, мутация мұндай мүмкіндікті азайтады немесе жояды;

Көрсетілген теориялық мүмкіндіктерден «қатысатын» мутация жоғары синтезде, бірақ толық емес биосинтезді реттеу туралы мәлімет, демек сол немесе басқа метаболит және клеткадағы басқа процестермен байланысы аяқталмаған кез келген келтірілген мутациядан жоғарғы синтезді тудыруы мүмкін.

Көбінесе бірнеше мутациялардың сәйкестелуі қажет, олардың арасында «негізгісі» және «көмекші» болуы мүмкін. Соңғылары бастапқыларының көрінуі үшін немесе біріншісінен көбірек көрінуі қажет. Егер селекционер бастапқы микроорганизмнің типін анықтап алған болса, бұл әртүрлі мутацияларды алудың аса қажеттілігі жоқ.

Сонымен қатар және теориялық қажеттіліктен микроорганизмде мутация алу үшін өнімділік деңгейінің болмауы және керісінше селекционер егерде ол бастапқы микроорганизм түрін сәтті таңдап көптеген әртүрлі мутацияны алу қажеттігінен қашуы мүмкін.

Селекцияға арналған бастапқы микроорганизмді таңдау

Табиғи формалардың әртүрлілігі микроорганизмді таңдауға жол береді, жоғары синтездеу үшін кез - келген заттың шегінің саны аз болады.

Демек, өте күрделі көрінеді және практикада ішек таяқшасында немесе псевдомонадта L-лизин өнімінің деңгейін өндірісте алу, бірақта оңай өкілдерінде глутаматпродуцирлеуші коринебактерия: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavит және т.б.

Бір қатар жағдайларда табиғи штаммдар ортаға аздаған күрделі жүйедегі шектелген жоғарғы синтезді азырақ мөлшерде біріншілік метаболит бөлінеді, мысалы, Eremothecium ashtyіi саңырауқұлақ штамы В₂ витаминін продуцирлеуге қабілетті, ал Propionibacterium shermanii В₁₂ витаминін продуцирлеуге қабілетті. Мұндай микроорганизмдер бөлген заттың жоғарғы деңгейдегі өнімі, селекция аумағы болып табылады.

Микроорганизмдердің жарамдығылына селекция аумағы ретінде қолдану үшін сол өнімнің продуцентін алуда бір немесе бірнеше белгіліні енгізу арқылы бақылауға болады, оған бірнеше теориялық анықталған мутацияларды енгізіп және нәтижесін тексеріп, басқа микроорганизмде тәжірибелі жолдармен тексереміз. Екіншілік метаболиттердің продуценттері үшін, сонымен қатар ферменттер немесе полисахаридтер үшін бастапқы штаммды таңдау, табиғи микроорганизмнің қажет затының өнімділік қабілеттімен анықтайды.

Кейбір жағдайларда сол бір затты табиғи штамм бөлетін болса, бірақ олар әр түрлі таксономиялық топтарға жататын болса, бұл болашақ өндіріске «технологиялық» тиімді немесе селекцияға бейім штамды таңдауға мүмкіндік жасайды.

Олай болса, селекционер штамм селекциясы үшін бастапқысын таңдауда көбінесе босамаған және әртүрлі генетикалық әдісті қолдану мүмкіндігінде және микробтық аумақты зерттеуде генетикасын таңдауда критерия болып саналмайды.

Штамның табиғи қасиеті, бұл таңдауды анықтаушылар, селекциялық жұмысты жеңілдетіп әрі жылдамдатады. Бірақ, көптеген өнеркәсіптік микроорганизмдерде генетикалық ақпаратпен алмасу жүйесі болмағандықтан синтездің генетикалық бақылауын анықтауға мүмкіндік жасайды, мутациямен жоғары синтездеу үшін қажет продуценті геноммен қанықтыруды жеңілдетпейді.

Селекциялық жұмысқа штамды дайындау

Морфологиялық мәні және сандақ мәні бойынша қажет өнімнің деңгейі селекция аумағы ретінде микроорганизмде алынған және бөлінген өнім.

Петри табақшасына бастапқы штамм егілгеннен кейін жүздеген колонияның кейбіреулері берілген культураның морфологиялық формасы үшін типті болып табылады. Сосын қиғаш косяктар бөлінген колониялар (клондар) типтік формасы (100 клоннан кем емес) өнімнің деңгейі бойынша бағаланып және едәуір жоғары және сенімді аналитикалық әдісті қолданып өнімділігі жоғары деңгейдегі бір клонды таңдап алынады. Мұндай жолдарды кейде «тазалау» деп атайды. Мұндай бағалау берілген затты продуцирлеу қабілеті мен колоннаның морфологиясының корреляциясы болуы мүмкін.

Бақылаушыға қарағанда өнімділігі жоғарылау бірнеше клон (қайта екпей-ақ) бастапқы болып саналады,бөліп алып бірнеше тәжірибеде қайталап тексеріп өнімділігіне тексереді, содан соң жоғарғы өнім беретінді сипаттайтын бір клонды алады. Мұндай процедураны кейде бастапқы «таза» культура деп атайды, өнімділігі жоғары клонды таңдауды жиі жүргізеді.

Егілгеннен бастапқы культурадан алынған клон қайта егіледі морфологиялық өзгергіштігін белгілейді, егер ол бар болса, демек колоннадан изолирленіп алынған косякта берілген клон үшін өнімділік деңгейі бойынша 100-типтен аса бар деп бағаланады.

Мұндай субклонның өнімділік деңгейінің мәні олар үшін (туысқан) клон бастапқы өнімге қатынасы бойынша пайызбен көрсетілген болса варирленген қатарларда таратылады және статистикалық көрсеткішін Х орташа арифметикалық, квадраттық ауытқу, σ өзгергіштік коэффициентін шығару тиімді.

CV- мәні бойынша клондаудың аяқталуын анықтауға болады. Сатылы клондаудың мақсаты – бастапқы культураның сандық мәні бойынша «тұрақтандыру», әрмен қарай өзгергіштігін бағалауды сенімді бақылау.Бұл қатардың шеткі бөлігіне түскен, субклондарды бөліп алып қайтадан өнімділік деңгейі бойынша бағалайды және солардың біреуін қалдырады.

Бұл субклонды егеді және алдыңғы жағдайлар бойынша 100 колоннан аз еместі қайталанады, строят вариационды қатарды құрады және оның көрсеткіші бойынша есептеп шығарады.

Осылайша алынған екі вариационды қатардың CV мәннін салыстырады

Егер осы екі мәндердің айырмашылығы болмаса, онда әрмен қарай селекцияны жүргізу үшін бастапқы штамды дайындауға болады, бірінші вариационды қатардан субклонды алу аяқталады, ал екінші қатарды мутагенді факторларды қолданып (бұл субклонның жеке қатары) селекциялық жұмыстың келесі қатары үшін бақылаушы деп санауа болады.Екінші қатардан CV табуда клонирдаудың тағы бір сатысын төмендеуге бірлесе жүргізу тенденция болуы мүмкін, екінші қатардың «жақсы» оң жағынан бөліп алып, оны егу қайта егу негізінде CV анықтап үшінші вариационды қатарды тұрғызуға болады.

Сатылы клондаудың мақсаты – бастапқы культураның сандық мәні бойынша «тұрақтандыру», әрмен қарай тұрақтандырғыш әсерінің негізінде индуцирленетін мутагенмен өзгергіштігін бағалауда сенімді бақылау ретінде популяцияның берілген мәні бойынша біркелкілеуін бөліп алу және келесі тізбекте мутагенді бөліп алу.Ескере кету керек,бөліп алынған культураның біркелкілігі көп рет пассирленгеннен және ұзақ уақыт сақтаудан төмендейді. Сондықтан бастапқы культура мутагенді таңдауда бақылаушы бола алады, аралық уақытта берілген культура үшін бекітілгенмен жүргізілген периодты клондауды ұстау керек.

Осылайша клондаудың өнімінің деңгейін жоғарылату, демек мутант таңдап алуға болмайды. Клонның өнімінің орташа деңгейі болып культураның табиғи өзгергіштігінің негізінде тұрғызылған вариационды қатардың оң жағынан алынған саналады.

Бұл жағдайда бастапқы культура қажет затты продуцирлемейді, берілген микроорганизмнің түрі бойынша таксономикалық сипаты толығымен сәйкес келетін колоннаның қайта егілгенінен таңдау керек және мутагенді қолданумен әрмен қарай жүргізілетін жұмыста осы клонды қолдану керек.

Мутанттарды алу

Мутациялардың әртүрлі типтерін әртүрлі физикалық және химиялық мутагенді факторлардың көмегімен алады.

Физикалық факторлармен споралардың немесе жасушалардың сулы суспензиясын өңдейді. (УФ-сәулелендіру, радиация).

Жасушаларды химиялық факторларымен (алкилирлеуші агенттермен) өңдегенде, берілген заттың мутагенді активтігін туғызатын шарттарды сақтау қажет. (рН сұйық, қатты фаза).

Физикалық мутагеннің әсер ету дозасы радиация типіне сәйкес сәулелендіру бірлігімен көрсетіледі.

Химиялық мутагендер үшін берілген доза температурамен, әсер етуші уақытпен және концентрациямен сипатталады. Химиялық әрекеттесуден кейін материалдарды жуып, оны буфер қоспасына салып қояды. Мутагеннің дозасын таңдағанда өңделген микроорганизмнің тіршілік етуіне қараймыз, ол 0,1 %- 50÷80 % дейін болады.

Оң мутанттарды алу

Кейде оң мутантты таңдау үшін табиғы таңдауды қолдануға болады. Мысалы,херест шарабының ашытқысы (Sacharomyces oviformis) спиртті тотықтыруға қабілеті бар өнімді хересті буклет шарабын алады, концентрленген спиртте 15% артық көбеймейді.Оларды культивирлеуде спирттің концентрациясы 18% дейін болады, осындай жағдайда херестің пайда болуына қабілетті штаммды бөліп алуға болады.

Кездейсоқ мутацияларды таңдау

Қажет өнімді синтездеу жолы жоқ мәлімет болған кезде осы әдіс қолданылады. Әдіс бірнеше сатыдан (мутагенді қолданумен сатылап бөліп алу) тұрады.

Әр саты: бастапқы культура әртүрлі тіршілікті қамтамасыз ететін, бірнеше дозалардан алынған бір немесе бірнеше мутагенмен өңделеді. 100-ден кем емес колонияны таңдамай-ақ әрбір тәжірибеден бөліп алынады. Мутагенмен өңдегеннен варианттардан кейін өнімнің деңгейін бастапқы культураның өнім деңгейінің мәнін % түрінде көрсетеді және вариационды қатарда анықталады.

Алынған вариационды қатарларды бастапқы культураның бақылау қатарымен салыстырады.

Салыстыру нәтижесінде (+) оң және (-) теріс варианттары алынады, олармен барлық клондарды есептейді, олардың өнімділік деңгейі бақылау қатарының х - ⁺2_а τ аралығында болады.

(+)оң варианты – әрмен қарай жұмыс жүретін материал үшін, (+)оң варианты берілген мутаген дозасын тағы бір рет қолдану үшін. Бірнеше сатылардан кейін барлық жақсы варианттарды қосады, нәтижелерін статистикалық өңдейді және оптимальды вариантты таңдайды.

Өнімнің деңгейін жоғарылататын мутанттарды таңдау әдістері.

Жасушаның мутагенін өңдегеннен кейін тірі қалғандар арасынан қажетті қасиетімен мутанттарды таңдап алу керек.

Мұны екі жолмен жасауға болады:

1. Берілген мөлшерлік белгісін бағалағаннан кейін «кездейсақ» мутацияларды таңдау, олай болса қажет заттың өнім деңгейі клон саны үлкен болуы мүмкін.

2. Анықталған фенотипті мутанттар арасынан берілген мөлшерлік белгісі бойынша таңдау, оларды тірі қалған клондардың санынан бөліп алу үшін таңдаудың арнаулы әдістері қолданылады.

Әдетте таңдаудың бірінші сатысы – тиімдірек, сосын жүру сатысы төмендейді, мұны болдырмау үшін мутагенді факторды ауыстырады, басқа селекционды сызыққа өтеді және тағы басқа.

Белгілі фенотиппен мутант ішіндегі сандық мәні бойынша бөліп алу

Берілген микроорганизмнің қажет өнімінің өзара синтезі мен реттеу жолы туралы мәліметтерді пайдалана отырып әдісті қолдану.

Ауксотрофты мутация

Ауксотрофтар - олардың өсуіне қажетті бір затты синтездеу қабілетін жұмсаған микроорганизмдер.

Оларды пайдалану ингибитордың пайда болуы немесе қажетті өнімнің синтезін блокирлеуге мүмкіндік жасайды, қажет өнімге өзгеруін тоқтатады. Белгілі әдістерді қолдана отырып ауксотрофты мутацияны мутагеннің көмегімен алады, мұндай мутагенді жеңілдетіп бөліп алу: байыту әдісі, жасуша минимальды ортада өсетін антибиотиктің әсеріне негізделген (демек, прототрофты), сондай-ақ реплик әдісі.

Алынған ауксотрофты мутанттарды қоректену қабілетіне қарай анықтайды, мутантты сол тұтынуымен бөліп алу және соңғысында қажетті өнімді продуцирлеуші қабілетін бағалайды. Егерде метоболит тұтынғанда әртүрлі сатыда оның синтезін блокирлеуге жағдай жасалған болса, онда әрбір сатыда мутатция пайдасын береді. Одан басқа да ауксотрофтылық синтездеу жолында блокты барлық уақытта тудырмайды. Сондықтан бірнеше ондаған мутантты алу керек және сапалы бірдей тұтынатын бірнеше ондаған мутанттың өнімділігін бағалау керек, егерде ауксотрофтылықтың есебі сенімді болса, өнімділігі жоғарыны (таңдау) алу керек және сол мутацияның қажет затының өніміне әсерін дәлелдеуді құру керек.

Ауксотрофты мутантты ревертрант ішінен таңдауда,бұл ауксотрофты метаболитті синтездеу жолында белгілі ферменттің деффектісін тудырады, сол өнімді каталитикалық синтездеуде ферменттің функциясының жұмсалуы, каталитикалық тотығуымен мутант алынады.

Өскен колоннаны «фон» құрайтын ауксотрофты жасушадан босату үшін минимальды ортаға (жеке) бөлек колонна болғанша егеді, оны табақшаға ревертанттың колоннасы пайда болғанша егеді. Минимальды ортада өскен колоннаны жарамды ортаға қайта егеді және алынған колоннадан қажет затты продуцирлеу қабілетін бағалау керек.

Құрылысының аналогына амин қышқылды немесе азот негізді резистентті мутанттардың ішінен бөліп алу

Сол заттың селекциялы жұмыс үшін жарамды болуы, табиғи метаболит бойынша синтездің реттеуші жүйеге әсер етуі, жасушадағы бұл метаболиттің функциональды негізгі қызметін атқара алмайды.

Жасушаның өсуін бәсеңдететін қабілеті және мұндай қабілетін жою, осылған табиғи метаболиттің қатысуымен селекциялық жұмыс үшін жарамдылықтың негізгі себебі болып саналады.

Аналого резистент мутант үшін бастапқы культураның жасуша суспензиясын өңдегеннен кейін табақшаға агарланған минимальды ортамен үлкен концентрацияны өңдегеннен кейін аналогты құрайтын бастапқы культуралардың өсуін ингибирлеушіні егеді. Бұл табақшада бірнеше тәуліктен кейін мутант колоннасының инкубациясы байқалады. Мутанттың мұндай бөлігі мутация болады, қажет метаболиттің синтезінің реттелуін бұзатын және мутацияның басқа бөлігі жасушада тасымалдау аналогын бұзатын оның жоғарғы синтезделуін тудырады.

Аналогымен бірге ортада өскен колоннадан бөліп алғаннан соң және әрбір бірінші колоннадан жеке клонды бөлу, қажет затты продуцирлеу қабілетін 1-2 клонда тексереді, аналық штамның ішіндегі өнімділігі орташадан жоғарысын бөліп алады. Содан соң барлық уақытта жәймен жоғарылататын аналогтың концентрациясын немесе басқа аналогымен сол метаболиттің тағы бірнеше сатысын жүргізеді. Бөліп алынған аналого резистентті штаммды зерттеу маңызды, демек ол жоғары синтездеуге бейімделген немесе оның деңгейін жоғарылататын.

Типтік мутацияның бүлінуінен жоғарғы синтезге әкеледі соңғы өнімді (метаболит) ингибирлеушіге (десенсибилизация) реттеуші ферменттің сезімталдық шығыны саналады, сонымен қатар фермент синтезінің репрессия механизмінің бұзылуына оны бақылау жасамайтын синтез қамтамасыз етіледі.

Резистентті антибиотике мутанттардың ішінен іріктеу

Бұл іріктеп бөліп алу әдісі антибиотик продуцентін селекциялауда қолданылады. Әртүрлі антибиотиктердің микроб жасушасына әсер ету механизмі де әртүрлі: кейбіреулері – ақуыз синтезінің ингибиторлары, басқалары – мембранатропты немесе ДНҚ-тропты агенттер. Антибиотикке мутанттарды резистенттін алады, құрамында әртүрлі антибиотиктердің концентрациясы бар немесе жасуша қоректік ортада споралардың суспензиясын егу мутагенсіз өңдеумен жүреді. Антибиотиктер тірі қалған колонияларда мрофологиялық мутанттардың пайда болуын индуцирлеуі мүмкін, сондай-ақ антибиотиктің пайда болу мәні бойынша үлкен өзгергіштікке әкеледі. Антибиотикттерді қолданып, препарат концентрациясын жәймен жоғарылата отырып, селекциялы жұмыстың бірнеше сатысы жүргізіледі.

Морфологиялық мутанттардың ішінен іріктеп бөліп алу

Ііріктеп бөліп алудың бұл түрі тек сандық мәні бойынша іріктелген жоғары өнімділікті штамдағы морфологиялық өзгерістерді анықтаудың жеке факторларына негізделген. Өнімділігі жоғары штаммдар көп жағдайда аз спора түзуші немесе жоғары спора түзуші болады, олар пигменттерін жоғалтады немесе жаңа түрін түзе алады, колонияның формасын немесе көлемін өзгерте алады. Мутагенді әсер етуден кейін тірі қалған колониялардың ішінен морфологиялық өзгергендерді жаппай іріктейді және оларды өнімділігі бойынша тексереді.

Барлық сипатталған әдістерді қолданудың негізгі мақсаты – «қажет» мутацияны іздеу диапазонын қысқарту, бұл ізденіс жұмыстардың көлемін азайтып, кездейсоқ мутацияны сатылы іріктеумен салыстырған тиімдірек.

продуцирлейді

продуцирлемейді