Лабораторная работа № 6.
Окраска спорообразующих и капсулообразующих бактерий.
Теоретические пояснения:
При неблагоприятных условиях для микробов (отсутствие питательной среды, высушивание, неблагоприятная температура и др.) в цитоплазме некоторых микроорганизмов образуются споры. Формируются они внутри вегетативной клетки, являясь эндоспорами. Палочковидные грамположительные микроорганизмы, образующие округлые споры, диаметр которых не превышает ширину микробной клетки, относятся к роду Bacillus и называются бациллами. Микроорганизмы рода Clostridium имеют споры диаметр которых превышает ширину микробной клетки и называются клостридиями. Споры устойчивы к воздействию высоких температур, химических веществ, к высыханию, длительно сохраняются в почве, что объясняется их особым строением и химическим составом, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки к действию красителей. Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву. После охлаждения оболочка вновь становится плотной и не пропускает дополнительный краситель.
Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой. Капсула - муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, является производным наружного слоя оболочки. Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила: мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется; фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метохромотические краски, то есть при использовании, которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула - в другой; промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.
Цель работы: усвоить методы окраски бактерий, образующих споры и капсулы.
Материалы и оборудование: 0,5% раствор хлороводородной кислоты, фуксин Циля, пинцет, спиртовки, фильтровальная бумага, микробиологические петли, промывалки с водой, микроскопы, иммерсионное масло, 5% раствор серной кислоты, метиленовый синий, черная тушь, фуксин Пфейффера, этиловый спирт 95 %.
Ход работы:
Окраска по Ожешко (выявление спор).
1. На мазок высушенном на воздухе наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.
2. Окрашивают по способу Циля – Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка – в голубой цвет.
Окраска по Цилю – Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий).
Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.
1.Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
2.Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2–3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.
3.Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий
Окраска по Бурри – Гинсу (выявление капсулы).
Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной (Рис.7).
Рис.7. Приготовление мазка для выявления капсулы бактерий
1.На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
2.Фиксируют химическим способом спиртом. Осторожно промывают водой.
3.Окрашивают фуксином Пфейффера 3–5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе. Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат. Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки – красные, капсулы – неокрашенные.
Вопросы для самоконтроля:
Для каких целей используют окраску Цилю – Нильсену
Чем образована капсула бактерий?
Что называется эндоспорой?
Чем отличаются споры Bacillus и Clostridium