Лабораторная работа № 3.
Техника приготовления мазка. Простые методы окраски микроорганизмов.
Теоретические пояснения:
Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высушенные и зафиксированные, подвергают окраске. Фиксацию осуществляют физическим путем в пламени спиртовки или химическим с помощью реагентов (этиловый спирт, формалин). Цели фиксации: обеззараживание патогенных микробов, закрепление клеток на стекле, убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители. Окраска бывает простая и сложная. Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенное время. Чаще всего для простой окраски применяют водно-спиртовый 1:10 фуксин, метиленовую синьку и сафранин. При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Обычно фуксином 1:10 красят 10–30 с, а метиленовой синькой – 2–10 мин. Фуксин и генцианвиолет окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов.
Цель работы: освоить технику приготовления постоянного микропрепарата и простых методов окраски микроорганизмов.
Материалы и оборудование: Обезжиренные предметные стекла, культура микроорганизмов, стеклянная палочка, спиртовки, спички, бактериологические красители (синька Леффлера или раствор фуксина), стакан с водой, пинцет, полоски фильтровальной бумаги, пипетка для краски, микробиологические петли, микроскопы, иммерсионное масло.
Ход работы:
Предметное стекло аккуратно берут за ребро и с обратной стороны нанесения мазка наносят его границы и номер культуры.
Зажигают спиртовку, горелку, предварительно выпустив пары спирта.
Фламбируют поверхность стекла, где будет располагаться мазок.
Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри.
В левую руку берут пробирку со стерильным физическим раствором (дистиллированной водой) и помещают между 1 и 2 пальцами таким образом, что ладонь находится под пробиркой и горлышко пробирки направлено в зону спиртовки.
В правую берут бактериальную петлю, как карандаш.
Петлю фламбируют до покраснения сначала горизонтально, затем вертикально (рис. 3).
Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку физ.раствора к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными.
Горло пробирки обжигают в пламени и вводят петлю.
Берут выпускной петлей физ. раствор и выносят на стекло пару капель в границы мазка.
Закрывают пробку, предварительно проведя через пламя спиртовки пробку и горло пробирки одновременно.
Ставят пробирку в штатив.
В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку с физ. раствором (см. пункт №5), петля в правой руке
Петлю фламбируют.
Над пламенем спиртовки спокойно вынимают пробку с культуры (см. пункт №8), одновременно обжигая пробку и горло пробирки.
Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки.
Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не касаясь ею стенок пробирки.
Петлю с культурой вносят в каплю физ. раствора и осторожно эмульгируют.
Бактериальную петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки.
Прожигают горло пробирки пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку.
Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив.
Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе либо высоко над пламенем спиртовки.
Рис. 3. Приготовление постоянного микропрепарата
После охлаждения стекла на мазок наносят пипеткой каплю красителя, оставляют его на 1–2 мин,
Прополаскивают стекло в стакане с водой, держа за край пинцетом, избыток воды удаляют фильтровальной бумагой и просушивают на воздухе.
Промикроскопировать микропрепарат с помощью иммерсионной системы и зарисовать в альбоме.
Вопросы для самоконтроля:
1. Какими методами проводится фиксация микроорганизмов на предметном стекле?
2. Какие красители используют для окраски микроорганизмов?
3. Сколько времени требуется для окрашивания мазка фуксином или
метиленовым синим?
4. Как приготовить и зафиксировать мазок из культуры микроорганизмов?