12 Билет 1 этапы развития микробиологии
Историю развития микробиологии можно разделить на 5 этапов:
1) эвристический – начинается с момента, когда Гиппократ (3-4 век до н.э.) высказал догадку (эвретика-догадка, домысел), что болезни передающиеся от человека к человеку, вызываются невидимыми неживыми веществами (миазмами). До открытия микробов, люди пользовались плодами деятельности микробов – виноделие, пивоварение, сыроделие, выпечка хлеба. В 15 – 16 в Джералимо Фракасторо, выразил мнение, что вызывают болезни “живые контагии” передающие болезни через воздух или предметы, живущие в окружающей среде, для борьбы с болезнями вызываемом “живыми контагиями” необходимо изолировать больного, уничтожить контагии.
2) морфологический – с конца 17 – начало 18 века. Левенгук открыл бактерии, создал микроскоп (ув 150-300 раз). Рассматривая (воду, кровь, налет с зубов) он обнаружил живые микроорганизмы (анималькумосы). После открытия Левунгука начали открываться новые бактерии, грибы, простейшие, в конце 19 были открыты вирусы. В 18 веке в микробиологии зародилась деонтология. В течении 18-20 столетия были открыты новые возбудители инфекционных болезней. В 1892 Ивановский открыл царство вирусов (при изучении мозаичной болезни Шабака).
3) физиологический – после обнаружения микробов, возник вопрос об их устройсте, биосвойствах, процессах жизнедеятельности, этиологии. Важную роль в этот период сыграли работы Луи Пастера, он открыл: 1) природу брожения, 2) анаэробиоз, 3) опроверг теорию самозарождения, 4) основал принцип стерилизации, 5) разработал принцип вакцинации и способы получения вакцин. Так же внес свой вклад Роберт Кох: предложил окраску бактерий, микрофотосъемку, способ получения ЧК. Изучение биологических и физиологических свойств микроорганизмов продолжалось с конца 19 в и в течении 20 в.
4) иммунологический – этот период связан с Пастером, Мечниковым и Эрлиха. Их можно называть основоположником иммунологии. Этот период начался во второй половине 19 в, встал вопрос, как можно защищаться от патогенных микробов, вызывающих инфекционные болезни. В конце 19 века Пастер обосновал принцип вакцинации и способ получения вакцины. Пастер показал, что ослабленный (температурой) возбудитель холеры кур, бешенства, сибирской язвы, потерявший вирулентные патогенные свойства, при введение в организм создает специфическую невосприимчивость к возбудителю. В 1983 Монтанье открыл ВИЧ.
5) молекулярно-генетический – развивался во второй половине 20 веке, в генетике, биотехнологии, генной инженерии, цитологии дало толчок к развитии микробиологии и иммунологии (молекул и генетических аспектов). Была расшифрована молекулярная структура бактерий и вирусов, строение и состав генома, структура факторов иммунной защиты. В результате достижения в микробиологии и иммунологии 20 века в обеспечили успехи в борьбе с инфекционными болезнями, открыли новые пути и методы диагностики и терапии неинфекционных болезней, связанных с нарушением иммунной системы.
2 применение вирулентных фагов
1) для лечения и экстренной профилактики (при угрозе заражения). Вирулентные фаги применяют:
Например: ,брюшнотифозный; дизентерийный; холерный Эль-Тор; коли – протейный;
cтафилококковый; гангренозные; синегнойный и др.
для диагностики (с целью установления вида неизвестного микроба). Например: испытуемый микроб высевают сплошным газоном на чашку с плотной средой, на которую наносят каплю известного видового фага и инкубируют в термостате. Если культура бактерий соответствует данному фагу, образуется "стерильное пятно".
3) для фаготипирования с целью установления источника заражения (применяются типовые фаги). Если штаммы, выделенные от больного и предполагаемого источника лизирутотся одними и теми же типовыми фагами (принадлежат к одному фаговару), это подтверждает общность их происхождения.
3 туберкулез
Возбудители туберкулёза — микобактерии (Mycobacterium tuberculosis, Mucobacteriuin bovis) - Гр+ тонкие изогнутые палочки без спор, капсул и жгутиков, из-за особенностей химического состава (повышенное содержание липидов) туберкулёзную палочку окрашивают как споры (по Цилю-Нильсену она окрашивается в бордовый цвет, фон - голубой). На простых средах возбудитель не растет; его выращивают, например, на яичной среде с крахмалом, глицерином и малахитовой зеленью для подавления роста сопутствующей микрофлоры (среда Левенштейна-Иенсена).
Для человека патогенны два вида микобактерий:
М. tuberculosis - тонкие слегка изогнутые палочки, которые лучше растут на средах с глицерином; источник инфекции - человек, заражение - воздушно-капельным или воздушно-пылевым путем; чаще развивается туберкулез легких;
M-bovis - толстые короткие палочки; к ним более чувствительны кролики; источник инфекции - сельскохозяйственные животные; заражение - чаше алиментарным (пищевым) путем; наблюдается туберкулез мезентериальных лимфоузлов.
Вирулентность микобактерий связана с эндотоксином и корд-фактором (гликолипидами клеточной стенки); аллергенные свойства связаны с клеточными белками. Инкубационный период - от нескольких недель до нескольких лет.
Заболевание протекает в различных формах и может генерализоваться с поражением органов мочеполовой системы, костей, мозговых оболочек, глаз, кожи.
Микробиологическую диагностику проводят путем микроскопии окрашенных мазков из материала, микробиологическим методом, путем заражения материалом от больного морских свинск (биологический метод); проводят также аллергодиагностику (пробу Манту с туберкулином).
Специфическое лечение: в соответствии с чувствительностью выделенного, штамма назначают антибиотики (стрептомицин, канамицин, рифампицин иди др.), препараты PACK (парааминосалициловой кислоты), препараты ГИНК (гидразиды изоникотиновой кислоты - фтивазид и др.)
Специфическая профилактика: в 5-7-дневном возрасте внутрикожно вводят живую вакцину БДЖ; ревакцинацию проводят лицам до 30 лет с отрицательной пробой Манту. Эту пробу ставят ежегодно путем внутрикожного введения туберкулина (специфического экстрагируемого белкового аллергена микобактерий туберкулёза). У взрослых проба Манту обычно положительна; при отсутствии клинических проявлений это свидетельствует об инфицированности организма туберкулезными палочками и, следовательно, о наличии иммунитета к туберкулёзу. У детей проба либо отрицательна, либо положительна с диаметром припухлости на месте введения 5-10 мм (прививочная аллергия). Если диаметр более 10 мм или за год интенсивность реакции нарастает на 6 мм и более, ребенок нуждается в дополнительном обследовании с цель» исключения или подтверждения туберкулёза.
13 билет. 1. Методы окраски
Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем. Чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.Простой метод окрашивания может быть применен и для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, и для прижизненной окраски микроорганизмов.
Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные (контрасные) способы окрашивания. К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Леффлера, а к негативным окрашивание по методу Бури.
Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффпера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера - смесь 2-х растворов (1 - метиловый синий, этиловый спирт, 2 – КОН.
Помимо позитивных способов окраски применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне. Часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью – метод окраски по Бури - фон препарата заливают жидкой тушью, тела микробов остаются неокрашенными. Тушь при этом разбавляют и стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах.
При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры. 1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные. 2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор. 3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии). 4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул. 5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы. 6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий. 7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.
2. Плазмиды
Плазмиды несут две функции — регуляторную и кодирующую. Первая состоит в компенсации нарушений ме- таболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плаз- миды в состав поврежденного бактериального генома, не способного к репликации его функция восстанавливается за счет плазмидного реп- ликона.
Кодирующая функция плазмид состоит во внесении в бактери- альную клетку новой информации, о которой судят по приобретенно- му признаку, например образованию пилей (F-плазмида), резистент- ности к антибиотикам (R-плазмида), выделению бактериоцинов (Col- плазмида) и т.д.
Переход плазмиды в автономное состояние и реализация запи- санной в ней информации часто связаны с индуцирующими воздей- ствиями внешней среды. В некоторых случаях продукты плазмидных 1енов могут способствовать выживанию несущих их бактерий. Само- стоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохране- нию и распространению в потомстве. Встраивание плазмид, так же как и профагов, происходит только в гомологичные участки бактери- альной хромосомы, в то время как Is-последовательностей и транс- позонов — в любой ее участок.
В настоящее время описано свыше двух десятков плазмид, из которых будут рассмотрены следующие.
F-плазмида, или половой фактор, представляет собой циркуляр- но замкнутую нить ДНК с молекулярной массой 60 • 106. Она контро- лирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способству- ют эффективному спариванию бактерий-доноров с рсципиентными клетками при конъюгации. Данная плазмида реплицируется в незави- симом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клет- ки бактерий-реципиентов.
Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra- опероном F-плазмиды (от англ. transfer — перенос), обеспечивающим се конъюгативность. F-плазмиду можно удалить (элиминировать) из
клетки, обработав последнюю некоторыми веществами, например акридиновым оранжевым, в результате чего клетки теряют свойства донора. Сравнительно легкая элиминация и очень быстрая и эффек- тивная передача F-плазмиды реципиентным клеткам дали основание считать, что она располагается в цитоплазме бактерий вне хромосо- мы. Однако F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромо- сому и находиться с ней в интегрированном состоянии.
R-плазмиды. Известно большое количество R-плазмнд, опреде- ляющих устойчивость бактерий-хозяев к разнообразным лекарствен- ным препаратам. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим привела к их широкому распространению среди патогенных и услов- но-патогенных бактерий, что чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний.
R-плазмиды имеют сложное молекулярное строение. В их состав входят: r-ген, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы — Is-последовательности, транспозоны и гга-опероны.
R-ген, ответственный за устойчивость бактерий к какому-либо антибиотику, контролирует синтез фермента, вызывающего его инак- тивацию или модификацию (см. 8.3). Значительное число г-генов является транспозонами, которые могут перемещаться от плазмиды- носителя в другие репликоны. В одном г-гене может содержаться несколько транспозонов, контролирующих устойчивость к разным ан- тибиотикам. Этим объясняется множественная лекарственная резис- тентность бактерий.
Гга-оперон, обеспечивающий конъюгативность плазмиды, входит в состав R-плазмид грамотрицательных бактерий. Грамположитель- ные бактерии содержат в основном неконъюгативные плазмиды, ко- торые могут передаваться от одной бактерии к другой путем транс- дукции.
Плазмиды патогенности. Данные плазмиды контролируют ви- рулентные свойства бактерий и токсинообразование. Они будут опи- саны в части «Учение об инфекции» (см. 10.2).
Бактериоцнногенные плазмиды контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ — бактериоцинов, способ- ных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бак- териоцины обнаружены у кишечных бактерий (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилокок- ков (стафилоцины) и др. Наиболее изучены колицины, продуцируе- мые кишечными палочками, шигеллами и некоторыми другими энте- робактериями.
Колицины энтеробактерий (продуцируемые под контролем колици- ногенных плазмид) представляют собой вещества белковой природы. Известно более 25 типов колицинов, различающихся по своим физи- ко-химическим и антигенным свойствам и по способности адсорбиро-
ваться на определенных участках поверхности бактериальных клеток. Они обозначаются латинскими буквами А, В, С, D, El, Е2, К и т.д.
При обычных условиях культивирования и большинстве клеток бактериальной популяции, содержащей колициногенные особи, синтеза колицина не происходит. Примерно в одной из 1000 клеток отмечает- ся так называемая спонтанная продукция колицина. Однако количество колнцинпродуцирующих клеток может быть резко увеличено при об- работке бактерий УФ-лучами и некоторыми другими агентами. При тгом погибают только сами клетки, продуцирующие колицины. В то же нремя бактериальные клетки, несущие Col-плазмиды, резистентны к действию гомологического колицина так же, как и лизогенные бакте- рии к действию гомологического фага. Таким образом, характерной чертой Col-плазмид является потенциальная летальность для клеток- продуцентов, которая сближает их с профагами (см. 5.4).
Механизм бактерицидного действия колицинов неодинаков. По- казано, что после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бак- 1ерий один из колицинов (ЕЗ) нарушает функцию рибосом, другой (К2) является ферментом — эндодезоксирибонуклеазой. Имеются колицины, действующие на цитоплазматическую мембрану бактерий.
Колициногенные (Col) плазмиды находятся в клетках энтеробак- герий в автономном состоянии и передаются при конъюгации без сцепления с хромосомой. Однако некоторые из них (ColV, ColB) могут встраиваться в бактериальную хромосому и находиться в ней в ин- тегрированном состоянии. Они, так же как и F-плазмиды, передают- ся путем конъюгации в реципиентные клетки, благодаря имеющему- ся у них /га-оперону.
Широкое распространение бактериоциногении среди микрофло- ры организма человека имеет экологическое значение как один из факторов, влияющих на формирование микробных биоценозов. Вме- сте с тем колицины, продуцируемые кишечной палочкой — нормаль- ным обитателем кишечника, могут губительно действовать на пато- генные энтеробактерии, попавшие в кишечник, способствуя тем са- мым нормализации его естественного микробиоценоза.
Способность продуцировать различные типы колицинов исполь- туется для типирования бактерий с целью эпидемиологического ана- лиза вызываемых ими заболеваний. Такое типирование осуществля- ется путем определения типа Col-плазмиды (к о л и ц и н о г е н о- гипирование) или типа колицина, образуемого патогенными бактериями (колицинотипирование), выделенными от больных, контактирующих с ними лиц, а также из окружающей среды.
Плазмиды биодеградации. Данные плазмиды несут информацию об утилизации некоторых органических соединений, которые бакте- рии используют в качестве источников углевода и энергии. Они мо- гут играть важную роль в экологии патогенных бактерий, обеспечи-
вая им селективные преимущества во время пребывания в объектах окружающей среды и в организме человека. Например, урологичес- кие штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины.
Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации ряда сахаров (лактоза, сахароза, рафиноза и др.) и образовании протеоли- тических ферментов.
3. Коклюш
Коклюш вызывает бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis) - Гр- полиморфная палочка без спор и жгутиков. В организме образует капсулу. На простых средах не растет; её выращивают на картофельно-глицериновой среде с кровью, на казеиново-угольном агаре. Образует мелкие гладкие блестящие (как капельки ртути) колонии, которые изучают с боковым освещением (они отбрасывают на среду конусовидный пучок света). Биохимически малоактивны. Идентификацию проводят по комплексу морфо-физиологических признаков и антигенной структуре. Возбудитель коклюша обладает эндотоксином и образует вещества типа экзотоксинов. Нестоек во внешней среде. Чувствителен к нагреванию, действию солнечного света, обычных дезинфектантов.
Источник инфекции - микробоноситель или больной человек, который заразен в последние дни инкубационного и в катаральном периодах инфекции. Заражение - воздушно-капельным путем. Чаще болеют дети. Заболевание сопровождается аллергизацией и протекает в несколько периодов: 1) катаральный (характеризуется симптомами ОРЗ); 2) спазматический (конвульсивный), когда токсины бордетелл раздражают окончания, блуждающего нерва и в мозге создается очаг возбуждения: отмечаются приступы неукротимого кашля, который часто заканчивается рвотой; 3)период выздоровления. Иммунитет клеточный и гуморальный, стойкий.
Микробиологическая диагностика в раннем периоде заболевания проводится путем выделения чистой культуры В. pertussis из мокроты, в более позднем - путем серодиагностики в РСК и др.).
Специфическое лечение: антибиотики, человеческий иммуноглобулин.
Специфическая профилактика: убитая вакцина (входит в состав вакцины АКДС).