32. Капиллярный электрофорез(кэ). Основы метода, электрофоре-тическое перемещение и электроосмотический поток, уширение полос.

Метод основан на разделении комп-тов сложной смеси к кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. В приборе, реализующий этот метод, капилляр заполняется раствором электролита, концами опущен во второй раствор того же электролита, в который введены электроды. Электролит обладает буферными свойствами для восприятия изменения состава раствора в приэлектродных пространствах и для стабилизации состояния компонентов пробы в процессе анализа. При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре устанавливается стационарное состояние, при котором через капилляр протекает постоянный электроосмотический поток (ЭОП), на который накладывается взаимно противоположная электромиграция катионов и анионов. Электроосмос определяет течение буферного раствора в электрическом поле в отличие от электрофореза, который обуславливает разделение частиц с различной подвижностью. ЭОП накладывается на электрофоретическое перемещение. Этот поток зависит от распределения зарядов вблизи поверхности капилляра. ЭОП связан с движением диффузной части двойного слоя, образующегося относительно заряженной поверхности внутренней стенки капилляра. Как правило, заряд поверхности определяется наличием отрицательно заряженных силанольных групп на поверхности немодифицированных кварцевых капилляров или создаётся за счёт дополнительной модификации поверхности. ЭОП направлен к катоду. Если в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить в эту зону к катоду и зона будет находиться под воздействием электрического поля высокого напряжения. В течение этого времени компоненты пробы, имеющие заряды и отличающиеся от компонентов ведущего электролита, будут перемещаться в соответствии с их подвижностями, специфическими для этого компонента. Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять ЭОП. Т.к. скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, то на выходе капилляра катионы компонента появятся первыми и тем раньше, чем больше электронная подвижность данного аниона. Анионный компонент, перемещаясь к аноду, будет двигаться со скоростью, меньше чем скорость ЭОП. Если время прохождения пробы в капилляре, которое регулируется длиной капилляра, скоростью ЭОП или в меньшей степени напряжением, достаточно и можно наблюдать зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы, поэтому происходит разделение исходной смеси. Увеличивающееся напряжение и возрастающая при этом напряжённость поля приводят к постоянному повышению скорости перемещения, к более высокой скорости анализа. Электрофоретичексая подвижность ионов связана со скоростью электрофоретического перемещения и напряжённостью поля. Электрофоретичексое разделение возможно лишь тогда, когда ионы различаются по их подвижности. Если зарегистрировать изменение концентрации компонентов на выходе, то полученная запись называется электрофореграммой и может служить основой для качественного и количественного анализа смеси. Качественной характеристикой в-ва является параметр удерживания (время миграции), а количественной – высота или площадь пика, пропорциональная концентрации в-ва. Для повышения воспроизводимости КЭ в присутствии ЭОП электроосмотический поток должен быть постоянным в течение всех проводимых определений, а сохранение постоянства ЭОП часто требует значительных усилий по подготовке до и после работы. В кварцевых капиллярах ЭОП уменьшается при увеличении концентрации электролита и добавлении органических растворителей и возрастает с увеличением рН, а также зависит от вязкости раствора в капилляре и температуры. Если же при добавлении катионных ПАВ к разделительному буферу на поверхности капилляра адсорбируется положительный заряд, то ЭОП меняет направление (с «от + к –» на «от – к +») и переносит разделительный буфер в направлении анода (+). Уникальная особенность ЭОП – плоский профиль потока в капилляре. Такой профиль выгоден, т.к. уменьшается размывание зон разделяемых в-в, меньшее уширение пиков. Эффективность разделения в КЭ прямо пропорциональна, а время анализа – обратно пропорционально напряжению, приложенному к электродам.

Основные причины уширения полос:

- продольная диффузия (соответствует теоретическому пределу, увеличивается с уменьшением молекулярной массы в-ва и с увеличением времени анализа);

- термические эффекты (приводят к конвенции и к локальным изменениям буфера. Влияния радиальных градиентов температуры и вязкости можно избежать только за счёт уменьшения диаметра капилляра);

- длительность ввода пробы (д.б.меньше, чем зона, возникающая в результате диффузии; м.увеличиваться для того, чтобы снизить порог обнаружения);

- адсорбция пробы на стенках (причина появления пиков с «хвостами» и плохой воспроизводимостью времени миграции);

- электродисперсия – различие в подвижностях (причина треугольной формы пиков);

- различие в уровнях жидкости (гидродинамический поток с соответствующим профилем потока).