26. Внутрилабораторный и внешний контроль качества.

Внутрилабораторный контроль качества — объективная проверка результатов

лаборатории, осуществляемая ежедневно непосредственно в лаборатории, преимущественное целью оценки воспроизводимости.

Внутрилабораторный контроль качества решает две основные задачи: контроль переменных внешних факторов (разные партии реагентов, калибровочных

материалов и пр.) и контроль стабильности выполнения методики в лаборатории.

Цель внутрилабораторного контроля качества — выявление и устранение отклонений от стабильного выполнения теста в лаборатории, т. е. выявление и устранение недопустимых аналитических ошибок.

Принцип проведения внутреннего контроля достаточно прост: периодически

(в каждой серии) нужно осуществлять измерение одного и того жеконтрольного материала, а результаты этих измерений заносить на контрольную карту.

Внешний контроль качества - система объективной проверки результатов лабораторных исследований, осуществляемая внешней организацией с целью обеспечения сравнимости результатов из разных лабораторий.

Мероприятия внешнего контроля качества позволяют обеспечивать качество и единство измерений в клинических лабораториях определенного административного или территориального региона. Внешний контроль качества осуществляется путем направления аттестованных контрольных образцов в зашифрованном виде для исследования в контролируемые лаборатории и последующей оценки результатов, полученных в этих лабораториях, в соответствии с разработанными критериями оценки качества.

27. Контрольные материалы внешнего и внутрилабораторного контроля качества.

При внутрилабораторном контроле используются контрольные материалы промышленного изготовления, допущенные в установленном порядке к применению на территории России. Вместе с тем, при невозможности приобрести контрольные материалы промышленного изготовления, в лаборатории могут использоваться контрольные материалы, которые готовятся из неиспользованных остатков образцов пациентов - слитые сыворотки, плазма, моча.

28. Методы исследования в гематологии.

1) определение гемоглобина крови;

2) определение свободного гемоглобина плазмы;

3) определение фракций гемоглобина;

4) подсчет эритроцитов в крови, вычисление эритроцитарных индексов;

5) определение гематокритной величины (показателя);

6) определение осмотической резистентности эритроцитов;

7) подсчет ретикулоцитов, вычисление ретикулоцитарных индексов;

8) подсчет тромбоцитов, вычисление тромбоцитарных индексов;

9) определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ);

10) подсчет лейкоцитов, вычисление лейкоцитарных индексов;

11) подсчет лейкоцитарной формулы с описанием морфологии форменных элементов крови;

12) подсчет миелокариоцитов;

13) подсчет мегакариоцитов;

14) подсчет миелограммы и характеристика костномозгового кроветворения;

15) подсчет сидероцитов и сидеробластов (в мазках периферической крови, в мазках костного мозга);

16) обнаружение клеток красной волчанки (LE-клеток)

Также гематологические методы исследования делятся на количественные и качественные.

29. Морфологические методы исследования в гематологии.

1. В мазках крови, окрашенных азур II-эозином.

2. В камере Горяева.

3. Электронно-автоматический метод.

4. Кондуктометрия

Оптическая микроскопия.

Оптическая микроскопия:

1. Ближнепольная оптическая микроскопия

2. Инфракрасная микроскопия.

Устройство микроскопа.

Оптический микроскоп-оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов, невидимых невооружённым глазом.

Уйстройство: Оптическая система микроскопа состоит из основных элементов — объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик. 

В современном микроскопе практически всегда есть осветительная система (в частности, конденсор с ирисовой диафрагмой), макро- и микро- винты для настройки резкости, система управления положением конденсора.

В зависимости от назначения, в специализированных микроскопах могут быть использованы дополнительные устройства и системы.

Приготовление тонкого мазка крови.

Чтобы мазок был правильно приготовлен, удобнее всего пользоваться предметными стеклами; на них наносят каплю крови и затем размазывают ее покровным стеклышком. Для приготовления мазка требуется только 1—2 капли крови. Сделав укол в палец, к выступившей капле, не касаясь пальца, прикладывают предметное стекло с какого-либо одного края. После этого стекло поворачивают каплей вверх и берут его первым и третьим пальцами левой руки. Первым и вторым пальцами правой руки берут покровное стеклышко, приставляют его плотно ребром к предметному стеклу, приблизительно под углом в 45°, подводят к капле крови и, после того как кровь распределится вдоль ребра покровного стеклышка, быстро проводят им по предметному стеклу; при этом получается тонкий равномерный мазок крови (52). После приготовления мазков предметные стекла на 5—10 минут кладут вверх той стороной, на которой размазана кровь, чтобы дать ей высохнуть.

30. Методы автоматизированного исследования клеток крови.

1. Метод Культера или кондуктометрический метод (основан на подсчете числа и

определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра).

2. Нефелометрия: исследование агрегациии тромбоцитов (метод Born, O’Briеn,1961);

3. Тромбоэластография: кинетика стабилизации сгустка крови и его растворения (метод опто-механического ротационного измерения);

4. Клоттинговые тесты:

- скрининговые (ПТ, АПТВ, ТВ, Рептилазное время, фибриноген… )

- активность отдельных факторов свертывания, физиологических

антикоагулянтов…

5. Хромогенные тесты:(активность A/К, факторов свертывания) активность ATIII, PC, Pl;

6. Иммунологические тесты: (количество отдельных факторов);

7. ПЦР: (ДНК-диагностика гемофилий, генных мутации фактора V, протромбина, MTHFR, интегриновых рецепторов Tr …);

8. Проточная цитофлуориметрия: (оценка рецепторов тромбоцитов, коагуляционно-активных микрочастиц…)

Принцип работы гематологического анализатора.

Принцип заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.

31. Дифференциальный подсчет лейкоцитов.

При подсчёте лейкоцитов используют методы Шиллинга или Филиппченко.

По Шиллингу определяют количество лейкоцитов в четырёх участках мазка (четырёхпольный метод). Всего в мазке подсчитывают 100—200 клеток.

Метод Филиппченко состоит в том, что мазок мысленно делят на 3 части: начальную, среднюю и конечную (трёхпольный метод). Подсчёт ведут по прямой линии поперёк мазка от одного его края к другому. В каждой части подсчитывают одинаковое количество клеток. Всего учитывают 100-200 лейкоцитов. Обнаруженные клетки записывают в специальную таблицу дифференциального подсчёта (сетка Егорова). Для более быстрого и удобного определения лейкоцитарной формулы применяют специальный 11-клавишный счётчик.

Виды лейкоцитов, лейкоцитарная формула.

Виды: нейтрофилы, базофилы, эозинофилы — по периферии, ближе к краям; моноциты, лимфоциты — ближе к середине.

Лейкоцитарная формула (лейкограмма)- процентное соотношение различных видов лейкоцитов, определяемое при подсчёте их в окрашенном мазке крови под микроскопом.

Нейтрофилы: могут присутствовать в малом количестве либо отсутствовать юные 1-5%; палочкоядерные 1-5% и сегментоядерные 40-68%. Они обладают, в основном, бактерицидной и дезинтоксикационной функциями. В норме содержание в крови: 48-78 %

Эозинофилы: также обладают фагоцитарными свойствами, но это свойство используют прежде всего для участия в аллергическом процессе. В норме: 0,5 – 5,0 %

Базофилы: участвуют в воспалительных и аллергических процессах в организме. В норме: 0 — 1 %

Моноциты: относятся к агранулоцитам. Они удаляют из организма отмирающие клетки, остатки разрушенных клеток, денатурированный белок, бактерии и комплексы антиген-антитело. В норме: 3-11 %

Лимфоциты: Т-, В- и NK-лимфоциты. Они участвуют в распознавании антигенов. Т-лимфоциты участвуют в процессах клеточного иммунитета, а В-лимфоциты — в процессах гуморального иммунитета. NK-лимфоциты (натуральные киллеры)— обладающие естественной цитотоксичностью против раковых клеток и клеток, зараженных вирусами.

В норме: 19 – 37 %

32. Цитохимические методы исследования лейкоцитов в гематологии.

Цитохимическое исследование используется для выявления функциональных изменений свойств клеток, изучения процессов внутриклеточного метаболизма к особенностей распределения различных веществ в клетках. Наиболее часто для анализа используют лейкоциты с целью определения вида лейкоза.

Основные цитохимические анализы лейкоцитов крови:

• щелочная фосфатаза (с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-ЩФ.)

• кислая фосфатаза (с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-КФ.)

• миелопероксидаза (с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-МПО.)

• реакция на железо (реакция Перлса, реакция с прусской лазурью) — данным методом определяется наличие железа в эритробластах (сидеробластах) и макрофагах костного мозга (сидерофагах).

• реакция с суданом черным- применяют для выявления принадлежности лейкоцитов к гранулоцитарному ряду – к нейтрофилам, эозинофилам, базофилам. У моноцитов положительность реакции значительно ниже.

• PAS реакция (или ШИК-реакция) применяется для выявления гликогена и полисахаридных скоплений.

• неспецифическая кислая эстераза и специфическая эстераза (анализы проводятся для дифференциации моноцитарных и лимфоцитарных заболеваний крови.)

33.Эритроцитарное, лейкоцитарное, тромбоцитарное звенья гемограммы. Показатели, получаемые на гематологических анализаторах, их нормы.

Эритроцитарное звено гемограммы:

HGB  –  концентрация гемоглобина в г/л определяется спектрофото­метрически гемиглобинцианидным методом.

RBC  –  количество эритроцитов в Т/л. Определяется путем подсчета объемным импедансным методом. Коэффициент вариации составляет 1-2%.

Расчетные эритроцитарные индексы: MCV, MCH, MCHC служат для качественной характеристики эритроцитов.

MCV –  средний объем эритроцита (всей популяции клеток) в фемтолитрах (фл).

Служит для характеристики типа анемии: микро-, нормо- или макроцитарная.

MCV у взрослых ниже 80 фл оценивается как микроцитоз, выше 100 фл - как макроцитоз.

MCH –  среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците в абсолютных единицах (норма 25-33 пг). Аналог цветного показателя. По MCH делят анемии на нормо-, гипо- и гиперхромные. MCH - более объективный показатель, чем цветовой показатель, который не отражает синтез гемоглобина и его содержание в эритроците, а во многом зависит от объема клетки.

MCHC –  средняя концентрация гемоглобина в эритроците, отражает степень истинного насыщения эритроцита гемоглобином, т.к. в отличие от MCH не зависит от объема клетки. Норма 300-400 г/л. Это наиболее стабильный гематологический показатель. Снижение MCHC наблюдается при заболеваниях с нарушением синтеза гемоглобина.

RDW –  степень анизоцитоза эритроцитов, рассчитывается как коэффициент вариации среднего объема эритроцитов (норма 11.5-14.5 %). Характеризует колебания объема эритроцитов внутри популяции и не связан с абсолютной величиной объема эритроцитов, поэтому нужно учитывать, что при наличии эритроцитов с измененным, но однородным размером (например, микроциты), значения RDW могут быть в пределах нормы.

HCT  –  гематокрит в %– сумма прямо измеренных объемов эритроцитов в единице объема крови. Характеризует степень гемоконцентрации и гемодилюции.

Для оценки анемий проводится дополнительное микроскопическое исследование мазка крови. 

Тромбоцитарное звено гемограммы:

PLT –  количество тромбоцитов в Г/л (подсчет объемным импедансным методом).

Тромбоцитарные индексы:

MРV –  средний объем тромбоцитов в фл (норма 4-10). Возрастает при ускорении тромбоцитопоэза. Снижение этого показателя наблюдают после спленэктомии и при синдроме Вискотта-Олдрича.

РDW –  степень анизоцитоза тромбоцитов в %. Норма – 12-18 %. Изменяется при миелопролиферативных заболеваниях.

РCT –  тромбокрит в % – отражает долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами. Норма – 0,09-0,4 %.

Лейкоцитарное звено гемограммы:

WBC – количество лейкоцитов крови в Г/л (подсчет объемным импедансным методом).

Коэффициент вариации 1 %.

34. Патологические формы и патологические включения эритроцитов.

Изменения размера (В основе изменений размеров эритроцитов лежит нарушение синтеза Hb.)

Микроцитоз , Макроцитоз. Мегалоцитоз Анизоцитоз

Изменения формы

Пойкилоцитоз — изменения различной степени выраженности формы эритроцитов, которая становится отличной от дисковидной. Это важнейший признак патологического изменения эритроцитов. В отличие от анизоцитоза, он развивается при сильно выраженных анемиях и является более неблагоприятным признаком. Изменения окраски: гипохромия, гиперхромия

Патологические включения:

Кольца Кебота — остатки ядерной оболочки мегалобласта, имеют вид колечка, восьмерки, окрашиваются в красный цвет. Кольца Кебота обнаруживаются при дизэритропоэзе, в частности при мегалобластных анемиях (витамин В₁₂- и фолиеводефицитных), талассемии, остром эритромиелозе.

Тельца Жолли — мелкие фиолетово-красные включения, присутствующие по 2-3 в одном эритроците, представляют собой остатки ядра мегалобласта. В норме тельца Жолли обнаруживают только в крови новорождённых. Их постоянно находят в мазках крови после спленэктомии. Тельца Жолли можно обнаружить при отравлениях гемолитическими ядами, анемиях различного генеза.

Базофильная зернистость — агрегированная базофильная субстанция в виде синих гранул, лучше выявляется при окраске метиленовым синим. Появляются при отравлении свинцом, но также возможно при сидеробластной и мегалобластной анемиях, талассемии.

Тельца Гейнца-Эрлиха — единичные или множественные включения, образованные из денатурированного Hb, которые выявляют при окраске метиловым фиолетовым. Тельца Гейнца-Эрлиха — первый признак наступающего гемолиза, их обнаруживают при отравлениях гемолитическими ядами, анемиях, вызванных дефицитом глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, глутатион редуктазы.

35. Анемии. Морфологическая классификация. Патогенетическая классификация.

Патогенетическая классификация

Основана на механизмах развития анемий как патологического процесса

• Дисгемопоэтические анемии — анемии, связанные с нарушением кровообразования в красном костном мозге

• Анемии, связанные с острой или хронической кровопотерей

• Анемии, связанные с повышенным гемолизом

Морфологическая классификация

I. Макроцитарная анемия (> 100 мкм (фл); (дефицит витамина В₁₂ и фолиевой кислоты, болезни печени, предлейкоз). II. Микроцитарная анемия (<80 мкм (фл), (дефицит железа, нарушения синтеза глобина, нарушение синтеза порфирина и гемма). III. Нормоцитарная анемия (81 —99 мкм (фл), (недавняя кровопотеря, гемолиз эритроцитов, гипо- и апластическая анемия, миелофиброз).

36. В12-дефицитная анемия, железодефицитные, постгеморрагическая, апластическая анемии. Изменение лабораторных показателей. Картина периферической крови.

Причины В12 дефицитной анемии

Итак, В12 – дефицитная анемия – это анемия, возникающая вследствие недостаточности витамина В12. Недостаток витамина В12 может быть вызван недостаточным его поступлением с пищей или нарушением его усвоения в желудочно-кишечном тракте. Недостаточное поступление цианкобаламина с пищей возможно у строгих вегетарианцев. Также недостаток В12 может проявиться при повышении потребности в нем у беременных женщин, кормящих матерей, раковых больных. Неусвоение витамина В12, поступающего с пищей в достаточном количестве, происходит при заболеваниях желудка, тонкого кишечника (дивертикулы, глисты) и лечении противосудорожными средствами или оральными контрацептивами.

Диагностика В12 дефицитной анемии

В системе крови происходит переход на мегалобластический тип кроветворения. Это означает, что в крови появляются гигантские эритроциты с укороченным сроком жизни, ярко окрашенные эритроциты без просветления в центре, грушевидные и овальные эритроциты с тельцами Жолли и кольцами Кабо. Также появляются гигантские нейтрофилы, уменьшается количество эозинофилов (вплоть до полного отсутствия), базофилов и общего количества лейкоцитов. В крови повышена концентрация билирубина, в связи с чем, может наблюдаться легкая желтушность кожи и склер глаз.

Железодефицитная анемия

Содержание железа в организме человека – 4 – 5 г или 0,0065% от массы тела. Из них 58% железа входит в состав гемоглобина. Железо может депонироваться (откладываться в запас) в печени, селезенке и костном мозгу. В то же самое время происходят физиологические потери железа с калом, мочой, потом, с менструацией и во время кормления грудью, поэтому необходимо включать в рацион питания железосодержащие продукты.

Диагностика железодефицитной анемии

В крови наблюдается снижение содержания гемоглобина до 60 – 70 г/л, эритроцитов до 1,5 – 2 Т/л, также снижено количество или вовсе отсутствуют ретикулоциты. Появляются эритроциты различных форм и размеров. Концентрация сывороточного железа ниже нормы.

Диагностика постгеморрагической острой анемии

В крови увеличивается количество ретикулоцитов более 11%, также появляются «незрелые» эритроциты и эритроциты с измененной формой клетки. Со стороны лейкоцитов наблюдается увеличение их общего количества выше 12 Г/л, а в лейкоцитарной формуле идет сдвиг влево. В последующие два месяца после острой кровопотери происходит восстановление показателей эритроцитов и гемоглобина. Однако восстановление количества эритроцитов и содержания гемоглобина связано с расходованием фонда железа в организме и может повлечь за собой развитие железодефицита. Поэтому в период восстановления после кровопотери необходимо соответствующее питание, то есть в рационе должны быть продукты с высоким содержанием железа (например, гранаты, гречка, печень и т.д.).

Диагностика хронической постгеморрагической анемии

В крови при хронической постгеморрагической анемии появляются слабо окрашенные эритроциты маленького размера, овальные эритроциты, снижено общее количество лейкоцитов, а в лейкоцитарной формуле наблюдается незначительный лимфоцитоз. В сыворотке крови концентрация железа ниже нормы – 9,0 мкмоль/л, также ниже нормального содержание меди, кальция, витаминов А, В, С, но, однако, повышена концентрация цинка, марганца и никеля в крови.

Апластические

Железообмен в организме нарушается, при этом количество железа в крови повышенное. Лейкоцитов в составе крови становится гораздо меньше, как и гемоглобина, а вот молодые формы эритроцитов вовсе отсутствуют. В каловых массах и моче часто присутствуют кровянистые примеси.

Л а б о р а т о р н ы е д а н н ы е. Гематологическими признаками аплазии костного мозга являются выраженная анемия (концентрация гемоглобина может падать до 20 - 30 г/л), лейкопения (нейтропения с относительным лимфоцитозом) и тромбоцитопения, иногда до полного исчезновения тромбоцитов из крови. Анемия чаще нормохромная и макроцитарная (СЭО) 94 мкм отмечается примерно у 60 - 65 % больных), число ретикулоцитов снижено. Содержание железа в сыворотке крови нормальное или повышенное, насыщение трансферрина близко к 100 %. В ряде случаев отмечается повышение уровня фетального гемоглсбина (НЬР составляет до 15% от общего гемоглобина) и эритропоэтина (поскольку продукция эритроцитов резко снижена, то либо существует ингибитор эритропоэтина, либо костный мозг к нему нечувствителен). СОЭ обычно увеличена до 40 - 60 мм/ч. При пункционной биопсии костного мозга получают малое количество ядросодержащих клеток (миелокариоцитов) или они совсем отсутствуют, при гистологическом исследоваиии отмечают замещение гемопоэтической ткани жировой тканью, Однако даже если биопсию производят в разных местах, то она не отражает состояние всего костного мозга: на аутопсии часто обнаруживают островки кроветворения (регенерации), содержащие двуядерные и многоядерные эритроидные клетки, среди значительно опустошенного костного мозга. При быстром прогрессировании болезни смерть может наступить через несколько месяцев, при хроническом течении происходит смена обострения и ремиссий. Иногда наблюдается полное выздоровление.

Диагноз и дифференциальный диагноз. Апластическую анемию предполагают при снижении в крови количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов (панцитопения). Диффереициальную диагностику следует проводить с острым лейкозом и В12-дефицитной анемией. Важное значение имеет стернальная пункция: при обнаружении гиперплазии эритроцитарного ростка апласти-ческая анемия исключается. Если увеличенные в количестве эритроидные элементы имеют морфологические черты мегалобластов, то вероятно наличие у больного В12-дефицитной анемии, но при этом необходимо иметь в виду и возможность эритромиелоза. Присутствие в костномозговом пунктате большого количества бластных клеток свидетельствует об остром лейкозе. Получение при пункции скудного материала еще не может быть расце-нено как указание на аплазию костного мозга, так как такая картина бывает и при остром алейкемическом лейкозе. Для уточнения диагноза производят трепано-биопсию кости; уменьшение активного кроветворного костиого мозга и увеличение жировой ткани подтверждает диагноз апластической анемии.