56. Реакция иммунофлюоресценции. …

РИФ - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на спо­собности некоторых флюорохромов вступать в химическую связь с сывороточными белками,  не нарушая их иммунологической специфичности. Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что Аг тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с АТ, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.  Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса Аг - АТ с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем АТ, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах АТ выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи АТ + антикроличьи АТ, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.  Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого ма­териала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей АТ против Аг возбудителя. Для образования комплекса Аг - АТ препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавших­ся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресци­рующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кро­лика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на Аг специфическими АТ образуются светящиеся   комплексы   Аг - АТ, которые   обнаруживаются   при   люминесцентной   микроскопии.

57. Ифа. Иммуноблоттинг

Иммуноферментный анализ или метод — выявление Аг с помощью соответствующих им АТ, конъюгированных с ферментом-меткой (щелочной фосфатазой). После соединения Аг с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интен­сивность окраски прямо пропорциональна количеству свя­завшихся молекул Аг и АТ. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных бо­лезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепати­та В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекар­ственных препаратов и других биологически активных ве­ществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (10¹⁰-10¹² г/л).

Твердофазный ИФА— вариант теста, когда один из компо­нентов иммунной реакции (Аг, АТ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых Аг или АТ. При положительном результате изменяется цвет хромоге­на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,  I. При определении АТ в лунки планшеток с сорбированным Аг последовательно добавляют сы­воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме­ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента. II. При определении Аг в лунки с сорби­рованными АТ вносят Аг (напр. сыворотку кро­ви с искомым Аг), добавляют диагностическую сыво­ротку против него и вторичные АТ (против диагностиче­ской сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хро­моген для фермента. Конкурентный ИФА для определения Аг: искомый Аг и меченный ферментом Аг конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества АТ иммунной сыворотки. Другой тест - конкурентный ИФА для определения АТ: искомые АТ и меченные ферментом АТ конкурируют друг с дру­гом за Аг, сорбированные на твердой фазе. Иммуноблоттинг — высокочувстви­тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис­пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Аг возбудителя разделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антиге­нов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся АТ боль­ного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [Аг + АТ больного + АТ против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.