5 Семестр

Лабораторная диагностика коринобактерий дифтерии

Знать:

1. Биологическую характеристику дифтерийной палочки

2. Питательные среды

3. Методы лабораторной диагностики дифтерии

4. Диагностические тесты необходимые для идентификации

5. Специфические иммунобиологические препараты

Уметь:

1. Взять материал из зева и провести первичный посев

2. Оценить культуральные свойства

3. Поставить диагностические тесты (пробы Пизу, проба Закса)

4. Поставить пробу на токсикогенность

Биологическая характеристика коринобактерий дифтерии

Возбудитель дифтерии — Corinobacterium diphtheriae (палочка Леффлера относится к роду Коринобактерий и представлена тремя биоварами gravis, mitis, intermedius.

К роду Коринобактерий относятся также сапрофиты, обитающие на слизистой нослоглотки — ложнодифтерийные палочки и дифтероиды.

Морфология: Гр+ тонкие палочки с утолщениями на концах в форме гантель. В утолщениях содержатся зерна волютина, выявляемые в окраске по Нейссеру. Неподвижны, спор и капсул не образуют. Окраска по Леффлеру — щелочным метиленовым синим (синька Леффлера) — зерна волютина окрашиваются более интенсивно. В мазке дифтерийные палочки располагаются попарно под углом к друг другу.

Сапрофитные коринобактерии располагаются частоколом, зерна волютина отсутствуют или располагаются на одном конце.

Тип дыхания — факультативные анаэробы.

Факторы патогенности — экзотоксин, ферменты патогенности.

Культуральные свойства. Растут только на средах содержащих кровь или сыворотку при температуре 37 градусов Цельсия.

Среда Ру-Леффлера — скошенная в пробирках лошадиная сыворотка с 25% бульоном и 1% глюкозой (желтая) используется для выделения ЧК. Рост через 14-18 часов в виде несливающихся колоний кремового цвета (вид шагреневой кожи).

Среда Клауберга — содержит кровь и теллурит калия (красная). Служит для первичного посева и одновременно является ДДС для биоваров дифтерийной палочки. Гравис-колонии в R-форме, крупные серо-черные с изрезанными краями. Митис-колонии в S-форме, среднего размера, черные, гладкие. Интермедиус — в S-форме, мелкие черные, гладкие (встречаются редко).

Среда Бучина — хинозольная среда синего цвета служит для первичного посева и позволяет отличить дифтерийную палочку от сапрофитных коринобактерий. Дифтерийная палочка — колонии синие. Ложнодифтерийные палочки — колонии голубые. Дифтероиды — колонии бесцветные.

Биохимические свойства. Дифтерийная палочка (все три биовара) расщепляют цистин до образования сероводорода и не расщепляю мочевину в отличии от сапрофитных коринобактерий.

По отношению к углеводам дифтерийная палочка расщепляет глюкозу и мальтозу до кислоты и не расщепляет сахарозу, лактозу, манит. Гравис в отличии от других биоваров расщепляет крахмал.

Антигенные свойства. К-аг — поверхностный белковый термонеустойчивый АГ. О-аг — соматический липополисахаридный типоспецифический АГ.

Питательные среды для коринобактерий дифтерии:

1. Среда Клауберга. Готовят в стерильных условиях из крови барана, глицерина, МПА, теллурита калия (красная).

2. Среда Бучина. К готовой хинозольной среде добавляют дефибринированную кровь (синяя).

3. Среда Пизу — МПА + раствор цистина + ацетат свинца + дефибринированная кровь. Разливают в пробирки столбиком (желтая). Посев уколом. Для определения цистиназы.

4. Среда Закса — раствор мочевины + феноловый красный + фосфаты натрия. Разлить в пробирки по 0,1 мл и стерилизовать текучим паром. Желтая. Для определения уреазы.

Методы лабораторной диагностики

1. Бактериологический

2. Бактериоскопический

3. Биологический (для определения силы экзотоксина убивающего морскую свинку).

Материалы для исследования зависят от локализации дифтерии.

1. Слизь из зева — собирают прямым ватным тампоном на границе пораженного участка и здоровой слизистой.

2. Слизь из носа — собирают одним тампоном из двух ноздрей.

3. Слизь из глаза, уха, влагалища — тампоном.

Правила забора и доставки материала:

1. При любой локализации дифтерии обязательно забирают материал из зева и носа.

2. Материал забрирают натощак.

3. Пробирки с материалом из зева и носа от одного пациента надписывают и связывают вместе.

4. Материал, собранный сухим тампоном должен быть посеян не позднее 2-3 часов после забора, лучше сразу.

5. При необходимости длительной транспортировки ватный тампон предварительно смачивают в физ. растворе.

6. В лаборатории посев ведут с каждого тампона отдельно.

7. Приготовление тампона: на толстую алюминиевую проволоку накручивают вату, монтируют в корковую пробку. Помещают в пробирку и стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160 градусах Цельсия 1 час, либо автоклавированием при 0,5 атм.

Алгоритм бактериологического исследования дифтерии

1 день

1. Микроскопия препаратов с тампона — РИФ, окраска по Леффлеру (мет.синий). Предварительный ответ.

2. Первичный посев тампоном на среду Клауберга или Бучина. Площадка сброса у края чашки и посев штрихом по всех поверхности. При выявлении бактерионосительства — посев на сектора. Термостат 37 градусов Цельсия на 18-20 часов.

2 день

1. Просмотр чашек. При замедлении роста оставляют еще на 24 часа. Отбор подозрительных колоний: R — серочерные, S — черные.

2. Выделение ЧК — пересев на скошенную свернутую лошадиную сыворотку (среда Ру-Леффлера) — термостат 37 градусов Цельсия 14 часов.

3 день

1. Просмотр ЧК — рост в виде шагреневой кожи кремового цвета. Проверка чистой культуры — приготовление препаратов и окраска по Нейссеру, метиленовым синим по Леффлеру.

2. Постановка проб:

а) на цистиназу (Проба Пизу)

б) на уреазу (Проба Закса)

в) на токсикогенность (РП в агаре)

г) на крахмал

д) посев на ряды Гисса

4 день

1. Учет результатов

а) Проба Пизу — появление почернения по месту укола — проба Пизу положительна (BL). Отсутствие изменений — проба Пизу отрицательна (дифтероиды).

б) Проба на уреазу. Отсутствие изменения цвета среды (желтая) — проба Закса отрицательна (BL). Покраснение среды — проба Закса положительна (дифтероиды и ложная BL).

в) Проба на токсикогенность. Наличие дуг преципитации — наличие экзоктоксина (BL). Отсутствие дуг преципитации — дифтероиды и ложная BL.

г) Изменение цвета среды с глюкозой и отсутствие изменений с сахарозой (BL).

Микроскопическая картина, характер роста на среде Клауберга. Положительна проба на токсикогенность, цистиназу и отрицательная на уреазу подтверждают выделение дифтерийной палочки. На биовар указывают: характер колоний на Крауберге и проба с крахмалом. Положительная проба на крахмал (его расщепление) — отсутствие изменения цвета среды — биовар гравис. Отрицательная проба на крахмал (крахмал не расщепился) — посинение среды — биовар митис.

Постановка проб:

1. Проба на токсикогенность — реакция преципитации в агаре для выявления экзотоксина выделенной культуры. Компоненты: выделенная культура, контрольная культура (токсикогенная), противодифтерийная антитоксическая сыворотка, агар Мартена. Учет через 24 часа при 37 градусах Цельсия по наличию или отсутствию дуг преципитации.

2. Проба Пизу — для выявления фермента цистиназы. В столбик среды Пизу (агар + цистин) уколом засевают выделенную культуру в термостат 37 градусов Цельсия на 24 часа. Учет — по почернению (черное облако) в месте укола.

3. Проба Закса — для выявления фермента уреаза. В пробирку с раствором мочевины и индикатором вносят бак.петлей исследуемую культуру. Учет — через 30 минут (37 градусов Цельсия) по появлению красного окрашивания.

4. Проба на крахмал — для выявления фермента диастазы. В пробирку с раствором крахмала бак.петлей вносят выделенную культуру. Через 30 минут (37 градусов Цельсия) в пробирку добавляют раствор йода. При расщеплении крахмала — цвет не изменяется. При отсутствии амилазы крахмал не расщепляется и при взаимодействии с йодом раствор синеет.

Биологическая характеристика бордетелл

Знать:

1. Биологическую роль бордетелл

2. Питательные среды

3. Методы лабораторной диагностики

4. Иммунобиологические препараты

Уметь:

1. Приготовить питательные среды

2. Забор материала методом кашлевых пластинок

Биологическая характеристика бордетелл

К роду Bordetella относятся возбудители:

1. Bordetella pertussis — коклюш

2. B. parapertussis — паракоклюш

3. B. bronchiseptica — бронхопневмония

Морфология: бордетелла коклюша — Гр- мелкие палочки овоидной формы, неподвижны, спор не образуют, есть микрокапсула.

Тип дыхания: аэробы (оксидаза положительна).

Фактор патогенности — эндотоксин, фактор патогенности.

Культивирование — растут на сложных средах при 36 градусах Цельси в течении 48 часов. Предохранять от высыхания. На угольно-казеиновой среде (КУА) колонии в S-форме, мелкие (1 мм), блестящие (капельки ртути). При снятии образуют вязкий сметанообразный след. Колонии образуют световой конус.

Бордетелла паракоклюша расщепляет белок тирозин, т. к. обладает ферментом тирозиназой (появляется коричневой окрашивание) и мочевину, т. к. есть фермент уреаза (диагностические признаки).

Антигенные свойства:

1. Родовой агглютиноген — 7

2. Видовой агглютиноген бордетелл коклюша — 1

3. Видовой агглютиноген бордетелл паракоклюша — 14

4. Видовой агглютиноген бордетелл бронхосептика — 12

5. Бордетелла коклюша имеет три серовара — 1, 2, 3; 1, 2, 0; 1, 0, 3.

Питательные среды: КУА (казеино-угольная среда) готовая, черного цвета. Среда Закса — раствор мочевины плюс фенолфталеин (определение уреазы).

Среда с тирозином — МПА + тирозин (определение тирозиназы).

Иммунобиологические препараты:

1. Родовая агглютинирующая сыворотка 7

2. Видовые агглютинирующие сыворотки 1, 14, 12 (адсорбированные)

3. Типа специфичные агглютинирующие сыворотки 1, 2, 3.

Сероидентификация

Материал для исследования — отделяемое слизистой носоглотки. Методы забора материала:

1. Метод кашлевых пластинок

2. Заднеглоточный способ

3. Носоглоточный способ

Методы диагностики:

1. Бактериологический