1. Микроскопический

2. Бактериологический

Алгоритм микробиологического исследования по стафилококку слизистого отделяемого носоглотки:

1. Забор материала (отделяемого из зева и носа) тампоном.

2. 1 день — микроскопия с тампона, окраска по Граму. При наличии Гр+ кокков в виде гроздьев дается ответ: наличие стафилококка.

3. Посев тампоном по секторам на ЖСА, МСА, КА — 37 градусов Цельсия 24 часа.

4. 2 день — отбор колоний с радужной зоны (ЖСА) и зоной гемолиза (КА) и пересев их на скошенный МПА для выделения чистой культуры — 37 градусов Цельсия 24 часа. Чашки с МСА оставляют при комнатной температуре на 2-3 дня для выявления пигмента.

5. 3 день — просмотр чистой культуры, проверка чистоты: мазок, окраска по Граму. С чистой культурой для дифференциации золотистого стафилококка от эпидермального сапрофитного ставят тесты.

РПК-реакция плазмокоагуляции. Разведенную в два раза цитратную плазму разливают в две пробирки по 0,4 мл. В первую пробирку петлей вносят чистую культуру, другая пробирка служит контролем. Помещают в термостат при 37 градусах Цельсия на 24 часа. При положительной реакции плазма свертывается и не выливается из перевернутой пробирки. В контроле плазма жидкая.

Ферментация маннита. В анаэробных условиях — посев уколом в столбик с маннитом, с последующей заливкой вазелиновым маслом. Выдержать в термостате при 37 градусах Цельсия 24 часа.

Чувствительность к новобиоцину — только сапрофитный стафилококк устойчив к действию новобиоцина. На питательный агар наносится новобиоцин и засевается чистой культурой. Выдерживается в термостате при 37 градусах Цельсия 24 часа.

6. 4 день — учет результатов.

Стафилококки	Коагулаза	Лецитиназа	Гемолиз	Маннит	Новобицин
Золотистый	+	+	+	+	Неустойчив
Эпидермальный	-	-	-	-	Неустойчив
Сапрофитный	-	-	-	-	Устойчив

Выделен золотистый стафилококк.

7. Фаготипирование (посев чистой культуры газоном и типируют 36 фагами при 37 градусах Цельсия 24 часа. Определение чувствительности к антибиотикам (посев газоном + диски с антибиотиками) при 37 градусах Цельсия 24 часа.

8. 5 день — учет фаготипирования и чувствительности к антибиотикам. Окончательный ответ: выделен S.aeroginosa, фаготип 13. Чувствителен к эритромицину, ванкомицину.

Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций

Знать:

1. Исследуемый материал при стрептококковых инфекциях; методики забора его и условия доставки в бак. лабораторию.

2. Предварительную подготовку доставленного материала к исследованию.

3. Методы диагностики применительные к стрептококкам.

4. Экспресс-диагностику стрептококков.

Уметь:

1. Оформить направление к исследуемому материалу.

2. Зарегистрировать поступивший материал в журнал.

3. Приготовить ватные тампоны для забора материала, простерилизовать их.

4. Приготовить питательные среды: КА, сыворотный агар, молоко с 0,1 метиленовой синью, желчь, среду с инсулином.

5. Сделать посев исследуемого материала на пластинчатые среды.

6. Выделить чистую культуру микроорганизма изучая демонстрационный рост стрептококков.

7. С демонстрационной чистотой культурой поставить дифференциальные тесты

8. Провести серотипирование Str.pneumoniae.

9. Провести микроскопию демонстрационных микропрепаратов Str.pyodenes, Str.pneumoniae, зарисовать.

Заболевание	Исследуемый материла, методика забора	1 этап исследования
Ангина	Слизь из зева (миндалин). Берут стерильным ватным тампоном натощак, или спустя 3-4 часа после еды. К тому же, взять материал до начала лечения.	Посев на КА, СА, Гарро
Нагноительные процессы кожи и ее дериватов.	Гной — берут стерильным ватным тампоном или стерильным шприцом.	Гр+, КА, СА, Гарро, Сах.Б или сыв. Б.
Воспалительные процессы полостных органов.	Моча — сбор в стерильную банку после естественного мочеиспускания с предварительным туалетом наружных мочеполовых органов или путем катетеризации. Если доставленная моча прозрачная, ее центрифугируют и исследуют осадок.	Гр+, КА, СА, Гарро
Ползучая язва роговицы	Отделяемое с роговицы берут стерильным ватным тампоном, смоченным стерильным физ. раствором.	- // -
Пневмония	Мокрота — утренняя порция, взятая натощак. Предварительно провести туалет ротовой полости. Сбор в стерильную широкогорлую банку — 20 мл.	Гр+, по Бури-Гинсу Посев на вышеуказанные среды. Постановка биопроб — мокроту эмульгируют и 0,5 мл вводят внутрибрюшно белой мыши. Через 5-6 часов берут брюшной экссудат, проводя микроскопию по Граму и Бури-Гинсу, засевают на плотные среды и проводят серотипирование.
Сепсис, эндокардит	Кровь на гемокультуру берут стерильным шприцем в асептических условиях в количестве 10-15мл. Посев крови на питательную среду сразу же после взятия.

К исследуемому материалу прилагается сопроводительный документ (направление), где указывают:

1. Наименование ЛПУ, отделение

2. ФИО больного, возраст

3. Цель обследования: болен, проф.обследование, контактный.

4. Вид исследуемого матриала

5. Дата, время забора матриала

6. Подпись мед.работника, производившего забор исследуемого материала.

7. Целевая установка - «материал на стрептококк».

При заборе важно:

1. Забор исследуемого материала осуществить до начала лечения.

2. Для забора исследуемого материала использовать стерильную лабораторную посуду

3. Проводить забор в асептических условиях

4. К исследуемому материалу нельзя добавлять химические консерванты, допускается консервация холодом.

5. С момента забора материала до начала анализа 3-4 часа.

Второй этап (через 18-20 часов термостатирования первичных посевов)

1. Изучение культуральных свойств микроорганизмов на пластинчатых и жидких средах. На кровяных средах — КА, Гарро, Шоколадный А — вирулентные штаммы Str.pyogenes дает мукоидные колонии в виде капель росы с зоной бета-гемолиза. Str.pneumoniae — зеленовато-серые, плоские с блюдцеобразным центром, гемолизом. На СА Str.pneumoniae — беловато-серые колонии. На жидкой среде Str.pyogenes дают придонно-пристеночный, мелкозернистый осадок, сам бульон прозрачный. Str.pneumoniae на жидкой среде дает помутнение с пылевидным осадком.

2. Часть подозрительной колонии подвергают микроскопии, окрасив препарат по Граму и Бурри-Гинсу.

3. Другую часть подозрительной колонии отсевают на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры и на бульон Мартена для получения солянокислого АГ.

4. При выделении гемокультуры, с сахарного бульона с признаками роста делают высев на пластинчатые среды (КА, СА, Гарро, шоколадный А). Если рост отсутствует, посев вновь помещают в термостат с последующим контролем роста, высев на пластинчатые среды через 2-3 дня. По показаниям посев выдерживают до 3 недель. При отсутствии роста выдают отрицательный результат, исследование прекращают.

Третий этап (через 18-20 часов)

1. Контроль роста на скошенном агаре, бульоне Мартена

2. Проверка чистоты культуры Гр+. При обнаружении Гр+ кокков, расположенных цепочками — подозрения на Str.pyogenes. При обнаружении Гр+ диплококков ланцетовидной формы — подозрение на Str.pneumoniae. Для идентификации подозрительной культуры ставят тесты: определение групповой принадлежности культуры по Ленсфильд (отличие от энтерококков), посев на молоко с 0,1 метиленовый синий (отличие от энтерококков), посев на среду с инулином, проба с желчью, проба с оптохином, серотипирование культуры — используя антипневмококковые сыворотки 1,2,3 и т. д.

Четвертый этап (через 18-20 часов) учет результатов

Приготовление группоспецифических антигенов (солянокислых)

1. Культуру, выращенную на бульоне Мартена, разлить по центрифужным пробиркам и центрифугировать 30 минут при 3000 об/мин.

2. Надосадочную жидкость слить в дез.раствор, к осадку добавить стерильный физ.раствор и вновь центрифугировать. Так проделать 2-3 раза.

3. К опытными микробным телам (осадку) добавить HCl -0,5 мл на 10¹⁰ микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Взвесь встряхивают, кипятят 15 минут, охлаждают, центрифугируют.

4. Отделяют надосадочную жидкость от осадка. Она содержит группоспецифичные антигены.

5. Нейтрализовать экстракт, добавляя в него 1 моль/л раствора гидроксида натрия. В качестве индикатора используют 0,01 мл 0,04% раствора бромтимолового синего. Во время нейтрализации экстракт из соломенно-желтого становится оливково-зеленым. Готовые экстракты хранят в холодильнике.

Определение групповой принадлежности культуры по Ленсфильд

Реакция кольцепреципитации:

1. В штатив набрать пять преципитационных пробирок

2. В четыре из них внести по 0,5 мл групповых стрептококковых сывороток — А, В, С, D. В пятую пробирку внести 0,5 мл. физ.раствора.

3. Последовательно во все пробирки осторожно наслаивается полученный соляный антиген.

4. Учет производят сразу: при положительной реакции в определенной пробирке на границе 2-х жидкостей появится молочно-белое кольцо.

Если исследуемая культура Str.pyogenes или Str.pneumoiae, то кольцо появится в пробирке с групповой сыворотой А, т. к. по Лесфильд эти возбудители по антигенному составу относятся к группе А.

Тест с желчью

1. В две пробирки внести 2-3 мл сывороточного бульона.

2. В одну из них добавить 10% желчи

3. В две пробирки внести 0,5-1,0 мл испытуемой бактериальной культуры и выдержать 60 минут при 37 градусах Цельсия.

4. Учет: если это культура пневмококка, в пробирке с желчью отмечается просветление бульона по сравнению с контролем, за счет лизиса пневмококка.

Тест с оптохином

1. Приготовить КА и СА, содержащий оптохин 1:50000

2. Разлить его в чашки Петри

3. Засеять чистую культуру

4. Термостатировать 18-24 часа

5. Учет: на среде с оптохином растет не Str.pneumoniae.

Тест на инулин

1. Приготовить питательную среду с инулином и лакмусовой настойкой

2. Засеять исследуемую культуру

3. Термостатировать 18-24 часа

4. Учет: при наличии Str.Pneumoniae среда окрашивается в красный цвет.

Серотипирование Str.Pneumoniae

1. Нанести на подготовленное предметное стекло 4 капли брюшного экссудата зараженной белой мыши, или чистой бульонной культуры.

2. К первой капле добавить антипневмококковую сывротоку I типа, ко второй капле антипневмококковую сыворотку II типа, к третьей — антипневмококковую сыворотку III типа.

3. К четвертой капле добавить каплю физ.раствора. (контроль)

4. Сыворотки I и II типа предварительно разводят 1:10, сыворотку III типа 1:5

5. Капли перемешать, высушить, зафиксировать фуксином Пфейффера.

6. Учет: микроскопия, при положительной реакции в одной из капель отмечается скучивание микробов (агглютинация).

Посев на молоко с 0,1% метиленовым синим

1. Внести в пробирку стерильное обезжиренное молоко с 0,1% метиленовым синим — 0,5 мл.

2. Провести посев чистой исследуемой культуры 1,0 мл.

3. Термостатировать при 37 градусах Цельсия 18-20 часов.

4. Учет: если молоко приобрело естественный цвет — рост энтерококков, если осталось голубым — рост Str.pyogenes.

Биологические особенности стрептококков

Пневмококк

Пиогенный стрептококк

Зоны альфа-гемолиза, бета-гемолиза и гамма-стрептококки, не вызывающие гемолиза.

1. Морфология: пиогенный стрептококк — Гр+ кокки, расположенные цепочкой, неподвижные, не образуют капсулы и спор (энтерококк имеет аналогичную морфологию). Пневмококк — диплококки ланцетовидной формы, неподвижные, не образует спор, капсула хорошо выражена (полисахаридная) Гр+

2. Культуральные свойства: не растут на простых средах, рост при температуре 37 градусов 24 часа, факультативные анаэробы. Пиогенные стрептококки в отличие от энтерококков не растут на средах с желчью. На КА — пиогенный стрептококк образует мелкие, мутноватые круглые колонии (капельки росы) с обширной зоной бета-гемолиза. Пневомококк — плоские с вдавленным блюдцеобразным центром, зеленовато-серые, с зеленой зоной альфа-гемолиза. На сахарном бульоне: придонно-пристеночный мелкокрошковидный рост, бульон прозрачный — пиогенный стрептококк. Пневмококк — пылевидный осадок, бульон слегка мутноватый.

3. Биохимические свойства: расщепляют сахара до кислоты. В отличие от других стрептококков пневмококки расщепляют инулин до кислоты и не расщепляют маннит. Протеолитические свойства выражены слабо.

4. Антигенные свойства: содержат липополисахаридный антиген А, устойчивый к нагреванию. А-антиген определяется в реакции преципитации. По А-антигену все стрептококки разделены на серогруппы: А, В, С, Д, Е и т. д. Патогенные относятся к группе А. Пневмококки имеют дополнительный К-антиген, который прикрывает А-антиген. По К-антигену пневмококки имеют серотипы: I, II, III, которые выявляются в реакции агглютинации с типовыми пневмококковыми сыворотками.

Подготовка к проведению микробиологического исследования

Приготовить питательные среды: КА (к приготовленному МПА температуры 45-50 градусов добавить в асептических условиях 5% дефибринированной крови и 1% глюкозы. Не стерилизовать) и сахарный бульон (к МПА 45 градусов Цельсия добавить 1% глюкозы, стерилизовать в автоклаве при 0,5 атм. 15 мин).

Микробиологическая диагностика менингококков и гонококков

Знать:

1. Биологические особенности менингококков и гонококков (цереброспинальный менингит, гонорея: патогенез, эпидемиология)

2. Исследуемый материал, забор, доставка в бак.лабораторию

3. Питательные среды

4. Методы микробиологической диагностики

Уметь:

1. Квалифицированный забор исследуемого материала

2. Доставить в лабораторию в оптимальных условиях

3. Приготовить микроскопические препараты

4. Провести первичный посев и выделить чистую культуру

5. Провести идентификацию чистой культуры

6. Оформить протокол микробиологического исследования

7. Составить заключение по результатам исследования

Биологические особенности менингококков

Neisseria meningitidis — патогенный диплококк, относящийся к роду Нейссерий и вызывающий цереброспинальный менингит, назофарингит и менингококковый сепсис.

Морфология: Гр- диплококки бобовидной формы, лежащие вогнутыми стенками друг к другу, наружные стенки выпуклые. Неподвижны, не имеют спор, образуют капсулу. В гнойном материале находятся внутри лейкоцитов. Тип дыхания — аэробы (капнофилы). Для их роста необходимо повышенное содержание углекислого газа и влажная среда. Очень чувствительны к низким температурам.

Патогенетические факторы: эндотоксин, нейраминидаза, капсула, пили. Культивирование: растут на сложных питательных средах, содержащих сыворотку (сывороточный агар) при 37 градусах и pH 7,2, при повышенном содержании углекислоты. Среды должны быть свежеприготовленные (влажные).

Культуральные свойства: при росте на плотных питательных средах менингококки образуют мелкие, нежные, голубовато-прозрачные колонии, вязкие в S-форме. На сывороточном бульоне дают мелкую муть и небольшой осадок.

Биохимические свойства: малоактивны. Расщепляют глюкозу и мальтозу до кислоты. Протеолитические свойства не выраженны.

Антигенные свойства: по полисахаридному капсульному антигену менингококки разделяются на серогруппы: A, B, C и другие. Церебральный менингит чаще вызывается серогруппой А.

Биологические особенности гонококка

Neisseria gonorhoae — патогенный диплококк, относящийся к роду Нейссерий, вызывает гнойные уретриты (гонорея острая и хроническая).

Морфология: Гр- парные кокки, имеющие вид кофейных зерен. Неподвижны, спор не образуют, имеют капсулу. Под действием антибиотиков могут образовывать Гр+ формы. В биологическом материале располагаются внутриклеточно — внутри лейкоцитов. Тип дыхания: аэробы, капнофилы.

Культивирование: растут только на средах, содержащих человеческий белок: сыворотка, кровь (СА, КА), безасцитная жидкость (37 градусов Цельсия, pH 7,2) с повышенным содержанием углекислоты. Посев проводят сразу после взятия материала. Среды должны быть влажными (свежеприготовленными).

Культуральные свойства: на СА колонии в S-форме: мелкие, прозрачные, блестящие (капельки росы).

Ферментативные свойства выражены слабо — расщепляют только глюкозу до кислоты. Протеолитическими свойствами не обладают.

Основной метод диагностики острой гонореи — микроскопия материала. Диагноз хронической гонореи ставится на основании бактериологического или серологического (РСК) исследования.

Лабораторная диагностика менингококка

Материал для исследования:

1. Спинномозговая жидкость (ликвор) при подозрении на эпидемический цереброспинальный менингит. Забор путем спинномозговой пункции. Доставка в лабораторию не позднее двух часов, предохраняя от охлаждения (в центрифужной пробирке).

2. Отделяемое слизистой оболочки носоглотки при подозрении на назофарингит и при обследовании на носительство. Забор материала стерильным ватным тампоном, укрепленным на гибкой алюминиевой проволоке. Перед забором материала тампон изгибают о край пробирки под тупым углом на расстоянии 3-4 см от того конца, на котором накручена вата.

3. Кровь, при подозрении на менингококкцемию (сепсис). Берут стерильно из локтевой вены 5-10 мл.

Материал берут до начала лечения, натощак или не ранее 3-4 часов после последнего приема пищи. Методы диагностики: микроскопический, микробиологический, серологический.

Алгоритм исследования

День первый:

Ликвор центрифугируют, осадок микроскопируют, окрашивая препарат водным раствором фуксина или метиленовым синим. Обнаружив диплококки бобовидной формы, расположенные внутри- и внелейкоцитарно — выдаем предварительный ответ. Далее, каплю ликвора засеваем на СА штрихами. Оставшийся осадок в центрифужной пробирке заливают полужидким СА. Посевы помещают в термостат при 37 градусах Цельсия.

Слизь и носоглотки, взятая стерильным тампоном с загнутым концом вверх. Извлекая тампон не касаться языка, щек, зубов. Посев сразу на чашки Петри с СА+линкомицин. Данный антибиотик подавляет рост сопутствующих Гр+ кокков в слизи, не действуя на менингококк. Засеянные чашки доставляют в лабораторию, охраняя от охлаждения и высыхания. Термостатирование при 37 градусах Цельсия.

Кровь, 5-10 мл помещают во флакон с сахарным бульоном в соотношении 1:10. Термостатирование при 37 градусах Цельсия.

Второй день:

Изучение культуральных свойств культур, выросших на чашках Петри (ликвор, слизь). При наличии подозрительных колоний их выделяют на чашки Петри с СА для получения чистой культуры. Посев штрихом. Термостатирование при 37 градусах Цельсия.

Изучение роста на сахарном бульоне (посев крови). При наличии его пересев на СА. При отсутствии роста посевы в колбе вновь помещают в термостат, выдерживая их до 10 суток с контрольными высевами на 3, 5 и 7 сутки. Если после 10 суток рост не появился на сахарном бульоне и на СА при контрольных высевах, выдаем отрицательный ответ и исследование прекращаем. Для стимуляции выделения гемокультуры посевы помещают в эксикатор с водой и зажженной свечой, что создает концентрацию углекислого газа в эксикаторе равной 70%.

Третий день:

Изучение роста чистой культуры, проверка ее чистоты — окраска метиленовым синим.

Постановка дифференциальных тестов для отличия от непатогенных Нейссерий (катарального диплококка):

1. Посев на МПА, термостатирование при 37 градусах Цельсия

2. Посев на СА, термостатирование при 37 градусах Цельсия

3. Посев на СА, оставить при 22 градусах Цельсия

4. Посев на ряды Гисса, куда добавить 0,25% сыворотки — термостатирование при 37 градусах Цельсия.

5. Постановка пробы на оксидазу: на колонии чистой культуры наносят каплю диметилпарафенилендиамина. Учет через 1-2 минуты. При наличии фермента оксидазы у культуры колонии окрашиваются в розовый цвет.

6. Определение серогруппы менингококка: на предметное стекло наносят по одной капле неразведенных (концентрированных) антименингококковых сывороток группы А, В, С и др, каплю физ.раствора (контроль). Последовательно в каждую каплю на петле добавляют чистую культуру и эмульгируют. Перед вносом культуры в очередную каплю, бак.петлю прожечь, чтобы антитела одной сыворотки, не попали в каплю другой сыворотки. Учет начинают с контроля — должен быть равномерно мутным. Наличие агглютинатов в одной из рабочих капель определяет группу менингококка.

Четвертый день:

Учет тестов после термостатирования.

Вид микроба	Рост на МПА, 37 градусов	Рост на СА, 37 градусов	Рост на СА, 22 градуса	Глюкоза	Мальтоза	Маннит	Лактоза	Сахароза	Проба на оксидазу
Менингококк	-	+	-	К	К	-	-	-	+
Непатогенные нейссерии	+	+	+	+ -	+ -	+ -	+ -	+ -	-

Лабораторная диагностика гонококка

Исследуемый материал:

1. Отделяемое слизистой оболочки уретры у мужчин, уретры и шейки матки у женщин. Забор стерильной петлей, ватным тампоном или ложечкой — соскоб.

2. Гнойные выделения из глаз при подозрении на бленорею. Берут стерильным ватным тампоном, увлажненным стерильным физ.раствором.

3. Кровь на серологию.

Материал для бактериологического и бактериоскопического исследования берут до начала лечения антибиотиками, не ранее чем через 2 часа после последнего мочеиспускания, после спринцевания.

Методы исследования: микроскопический — главным образом используется при острых формах, микробиологический, серологический.

Острая форма гонореи

Из материала делают мазки на двух предметных стеклах, растирая его на ½ стекла. Мазки фиксируют над пламенем горелки, окрашивают водным раствором метиленового синего и по Граму, используя водные растворы красителей. В поле зрения видим: цитоз за счет лейкоцитов и слущенных эпителиальных клеток. Гонококки — диплококки бобовидной формы, расположенные внутри- и внелейкоцитарно. Выдаем ответ.

Хроническая гонорея

При нерациональной терапии гонококки не погибают, а меняют свою морфологию, тинкториальные свойства (тела Аша) и микроскопическим методом подтвердить диагноз трудно. В таком случае используют бактериологический метод, производя посев на специальные среды. Гонококк плохо культивируется на питательных средах, поэтому необходимо создать максимум оптимальных условий:

1. Среды должны быть свежеприготовленные, влажные, теплые, оптимального состава. В настоящее время используют бесасцитные среды, среду Легру, среду Соколова.

2. Посевы инкубируются при 37 градусах Цельсия в эксикаторе с 10% углекислым газом.

Второй этап (через 24 часа и позже)

Изучение культуральных свойств культуры, выросшей на чашке Петри, микроскопия подозрительных колоний. Видим Гр- диплококки бобовидной формы.

Ставим тест на оксидазу — на колонию наносим 1 каплю диметилпарафенилендиамин. Колония изменяет цвет от темно-коричневого до черного. У гонококка оксидаза «+».

Пересев подозрительных колоний в пробирку со скошенной специальной средой для выделения чистой культуры.

Третий этап (через 24 часа)

Проверка чистоты выросшей культуры

Определение сахаролитической активности на среде ферментации (аналог рядов Гисса). Среда ферментации представлена пятью чашками Петри. В каждую чашку вносят питательную среду на яичной основе и индикатор, затем добавляют углеводы — в каждую чашку свой углевод. Посев исследуемой культуры «крестиком» на каждую из пяти чашек. Таким образом, на пяти чашках можно испытать 6-7 исследуемых культур.

Учет через 24-48 часов. Гонококк способен расщеплять до кислоты (к) только глюкозу. Рост в виде «крестика» на чашке с глюкозой приобретают желтое окрашивание. Сама среда с индикатором бромтимоловым синим — травянисто-зеленая. Таким образом на основании: тинкториальных, морфологических, культуральных свойств, ферментативной активности (оксидаза «+», гл до «к») выдаем ответ о выделении гонококка.

Серологический метод: при хроническом течении заболевания и в сомнительных случаях ставят РСК, РНГА.

Микробиологическая диагностика возбудителя раневой инфекции клостридии столбняка

Знать:

1. Биологические особенности клостридий столбняка

2. Столбняк — патогенез, эпидемиология, лечение, спецпрофилактика

3. Имуннобиологические препараты

4. Методы микробиологической диагностики

Уметь:

1. Квалифицированный забор исследуемого материала

2. Подготовку исследуемого материала к исследованию

3. Культивацию в анаэробных условиях

4. Оформить протокол микробиологического исследования

5. Составить заключение по результатам исследования

Возбудители раневых анаэробных инфекций — столбняка и газовой гангрены — Гр+ анаэробные спорообразующие палочки — клостридии. Раневые инфекции всегда сопровождаются загрязнением ран аэробными гноеродными кокками — стафилококками и стрептококками. Для создания анаэробных условий при проведении лабораторной диагностики используют специальные методы взятия материала, элективные питательные среды и специальную аппаратуру для культивирования анаэробов.

Материалы для исследования, забор и доставка

Гной, раневое отделяемое, отечная жидкость, кусочки мышечной ткани, а также перевязочный материал и кетгут (проверка стерильности). Материал берут из разных участков очага, особенно из глубоких слоев. Для обеспечения бескислородных условий взятие материала производят шприцем с притертым поршнем до полного его заполнения и вытеснения воздуха. Затем шприц надевают на иглу, воставленную через резиновую пробку в пробирке со смесью инертный газов (без кислорода) и вводят в нее исследуемый материал, который доставляют в лабораторию.

Питательные среды для выращивания анаэробов

Пробирочные среды:

1. Тиогликолевая среда (полужидкий агар) — среда накопления;

2. Среда Китта-Тароцци (жидкая) — среда накопления и выделения чистой культуры. Среду Китта-Тароцци перед посевом регенерируют кипячением 20 минут.

3. Среда Вильсона-Блера (плотная, высокий столбик) — для первичного посева. Расплавленной и горячей (60 градусов Цельсия) средой Вильсона-Блера заливают внесенный в пробирку материал.

После посева все среды охлаждают под холодной водой и заливают вазелиновым маслом.

Чашечные среды:

1. Кровяной агар с глюкозой (агар Цейсслера).

Посевы на чашки осуществляются методом Фортнера, Штурм и др. После посева края чашки заливают парафином. Все посевы помещают в анаэростат и ставят его в термостат.

Имуннобиологические препараты для диагностики, лечения и профилактики раневых инфекций

1. Противостолбнячная антитоксическая сыворотка — нейтрализует действие столбнячного токсина (диагностика, лечение и профилактика)

2. Столбнячный анатоксин — входит в состав АКДС (коклюшно-столбнячно-дифтерийная вакцина) — для вакцинации.

Методы лабораторной диагностики

1. Биологическая проба (основной метод) — реакция нейтрализации токсинов.

2. Микроскопический метод

3. Бактериологический метод (при отрицательной биопробе с целью получения чистой культуры и повтора с ней биопробы).

Биологические особенности клостридий столбняка

Возбудитель столбняка Clostridium Tetani относится к роду Клостридий (анаэробных Гр+ спорообразующих палочек).

Морфология: крупные (4-8 мкм), палочки с закругленными краями. Споры располагаются терминально, что придает вид барабанной палочки. Подвижны, перетрихи. Тинкториальные свойства: Гр+. Метаболизм: ферментативный, хемоорганотрофы. Тип дыхания: строгий анаэроб.

Патогенетический признак — экзотоксин (тетаноспазмин и тетанолизин), вызывающий гемолиз эритроцитов.

Культивирование: растут в анаэробных условиях при 37 градусах Цельсия на среде Китта-Тароцци, Вильсона-Блера, агаре Цейсслера через 72 часа.

Культуральные свойства: помутнение Китта-Тароцци, на среде Вильсона-Блера — в толще агара темные колонии в виде пушинок, на агаре Цейсслера — прозрачные колонии с зоной гемолиза.

Биохимические свойства: сахаролитически не актвен.

Протеолитические свойства: медленно разжижает желатину, свертывает молоко, восстанавливает нитриты и нитраты.

Антигенные свойства: по О и Н антигену различают 10 сероваров, однако все они продуцируют токсин одного типа (видовой).

Алгоритм микробиологического исследования при столбняке

Первый день

Микроскопия исследуемого материала — окраска по Граму и по Ожешко. Наличие Гр+ спороносных (барабанных) палочек позволяет выдать ориентировочный ответ: клостридии. Исследуемый материал делят на две порции (для биопробы и бакисследования).

Часть материала засевают на среду накопления Китта-Тароцци и культивируют в анаэробных условиях при 37 градусах Цельсия в течение трех дней.

Для постановки биопробы из другой части материала экстрагируют анатоксин. С этой целью материал растирают в стерильной ступке с песком, заливают физ.раствором для экстракции токсина на 1 час и фильтруют через бумажный фильтр. Полученный фильтрат токсина делят на 2 порции.

Первая порция опытная, вторая порция контрольная — в нее добавляют противостолбнячную сыворотку и для нейтрализации токсина оставляют на 1 час. В опыт берут две пары мышей которым внутримышечно вводят: первой (опытной) паре мышей — фильтрат токсина без сыворотки, второй паре (контрольной) — фильтрат токсина с сывороткой.

Через 1-2 суток в опытной группе мышей появляются признаки столбняка: ригидность конечностей, хвоста (хвост трубой). Затем животные погибают в характерной позе: поджав передние лапки и вытянув задние. У контрольных мышей получивших антитоксическую сыворотку заболевания не возникают.

На основании положительной биопробе ставится окончательный диагноз: столбняк.

При отрицательном результате биопробы (все мыши живы) продолжают бактериологические исследования.

Со среды накопления Китта-Тароцци (2-3 сутки) делают пересевы на агар Цейсслера, культивируют в анаэробных условиях, изучают культуральные свойства (прозрачные колонии с зоной гемолиза), микроскопируют.

На 4-5 день для выделения чистой культуры пересевают на среду Китта-Тароцци и ставят биопробу с чистой культурой.

При отрицательном результате выдается отрицательный ответ.

Микробиологическая диагностика возбудителя раневой инфекции. Клостридии газовой гангрены.

Знать:

1. Биологические особенности клостридий газовой гангрены

2. Газовая гангрена — патогенез, эпидемиология, лечение, спецпрофилактика.

3. Иммунобиологические препараты.

4. Методы микробиологической диагностики

Уметь:

1. Квалифицированный забор исследуемого материала

2. Подготовку исследуемого материала к исследованию.

3. Культивацию в анаэробных условиях.

4. Оформить протокол микробиологического исследования.

5. Составить заключение по результатам исследования.

Биологические особенности клостридий газовой гангрены

Газовая гангрена вызывается группой анаэробных палочек относящихся к роду Clostridium (анаэробных Гр+ спорообразующих палочек), семейства Bacillac. В 90% газовая гангрена вызывается C.Perfringens, реже C.Novy, C.Septioum, C.Histoliticum, C.Sordelii и всегда сочетается с гноеродными кокками — стафилококками и стрептококками.

Развитие газовой гангрены связано с выработкой некротического экзотоксина. Некоторые серовары клостридии перфрингенс синтезируют энтеротоксин приводящий к развитию ОКИ (острой кишечной инфекции).

C.Perfringens

Морфология: крупные (4-8 мкм) палочки с закругленными краями. Споры располагаются центрально. Неподвижны в отличии от других клостридий.

Тинкториальные свойства: Гр+.

Метаболизм: ферментативный, хемоорганотрофы.

Тип дыхания: анаэроб (менее строгие, чем другие клостридии).

Патогенетический признак: экзотоксин.

Культивирование: растут в анаэробных условиях при 37-42 градусах Цельсия, pH 7,2 через 6-8 часов. Рост сопровождается бурным газообразованием.

Культуральные свойства: помутнение и газообразование на среде Китта-Тароцци, на среде Цейсслера — прозрачные, оливково-зеленые колонии c зоной гемолиза, на Вильсона-Блера — в виде чечевичных зерен.

Биохимические свойства: сахаролитически активен — ферментирует лактозу, сахарозу, мальтозу с образованием кислоты и газа.

Протеолитические свойства: медленно разжижает желатину, свертывает молоко, восстанавливает нитриты в нитраты. Индол не образует, образует сероводород.

Антигенные свойства: различают 5 сероваров клостридий перфрингенс — A, B, C, D, E отличающих друг от друга по антигенам и биохимическим свойствам токсинов.

Алгоритм микробиологического исследования при газовой гангрене

Первый день. Микроскопия исследуемого материала, окраска по Грамму и по Ожешко. Наличие Гр+ спороносных палочек позволяет выдать ориентировочный ответ: клостридии. Исследуемый материал делят на две порции (для биопробы и бакисследований). Часть материала засевают на среду Китта-Тароцци, Вильсона-Блера и агар Цейсслера. Культивируют в анаэробных условиях при 43 градусах Цельсия. При появлении через 6 часов признаков роста (почернение и разрывы высокого столбика Вильсона-Блера, а также наличие зоны гемолиза, колоний на среде Цейсслера). Выделяют чистую культуру на среде Китта-Тароцци.

Проводят идентификацию по морфологии, биохимической активности и подвижности. Для определения видов возбудителей газовой гангрены ставят биопробу.

Для постановки биопробы из другой части материала экстрагируют экзотоксин. С этой целью материал растирают в стерильной ступке с песком, заливают физ.раствором для экстракции токсина на 1 час и фильтруют через бумажный фильтр. Полученный фильтрат токсина разливают в 5 пробирок по 0,9 мл.

В каждую пробирку приливают по 0,6 мл антитоксических сывороток против каждого возбудителя газовой гангрены: перфрингенс, новви, септикум, хистолитикум, сорделли. В 6 пробирку вносят физ.раствор.

Смесь токсина с антитоксическими сыворотками оставляют при комнатной темпетаруре на 40 минут для нейтрализации токсина. В опыт берут шесть пар мышей, которым внутривенно вводят по 0,5 мл из каждой пробирки. Гибель животных наступает в сроки от 5 часов до 3 дней. При положительном результате в живых из 12 мышей остаются контрольные мыши и одна пара из опытных мышей, у которых произошла нейтрализация токсина соответствующей антитоксической сывороткой.

Если остались живы мыши, которым ввели смесь токсина с сывороткой перфрингенс, дают ответ: С.Perfringens. При отрицательном результате биопробы стявят биопробы с чистой культурой.

Схема диагностики газовой гангрены

Первый уровень:

1. Характеристика возбудителя (микроскопические свойства, культуральные свойства, ферментативные свойства)

2. Патогенез, клинические проявления (материал для исследования — отделяемое раны.)

3. Профилактика (специфическая, неспечифическая).

Второй уровень. Выбор методов исследования: