Занятие 1.

Правила техники безопасности при работе в микробиологической лаборатории

1. К работе допускаются сотрудники только после ознакомления с правилами поведения и режимом работы

2. Работать в спецодежде.

3. На рабочем месте запрещается принимать пищу, пить курить, пользоваться косметикой

4. На рабочих столах для обработки рук и поверхностей должны находится — 70-градусный спирт, 6% перекись водорода или дезраствор, используемый в лаборатории

5. Поступающий материал регистрируют в специальном журнале и маркируют. Материал для исследований считается инфицированным.

6. При работе с исследуемым материалом следует избегать уколов и порезов, все повреждения на руках должны быть закрыты лейкопластырем или напальчниками.

7. Работать с биологическим материалом следует только в резиновых перчатках

8. Во избежание ранений не допускается использование стеклянных предметов с отбитыми краями.

9. Переливать исследуемый материал из одной емкости в другую следует над дезраствором.

10. Жидкий материал с помощью резинового баллона, надетого на бутылку.

11. Для предупреждения разбрызгивания биологического материала, следует плотно закрывать пробирки пробками.

12. Биологических материал должен транспортироваться в штативах, помещенных в контейнеры, на дно которого укладывают 4-х слойную сухую салфетку (на случай боя посуды или случайного опрокидывания).

13. По окончанию работы руки и инструменты обрабатывают дезраствором

14. Культуры обезвреживают автоклавированием.

15. Культуры, необходимые для работы, хранят в холодильнике, регистрируют в журнале. Указывают количество культур, дату поступления, пересева и уничтожения культур.

16. Влажная уборка производится ежедневно с применением дезрастворов.

17. На рабочих местах должны быть выписки из инструктивно-методических документов, аптечки для проведения экстренной профилактической помощи при аварийных ситуациях.

Микробиологическая лаборатория, оборудование, оснащение

Знать:

1. Задачи микробиологической лаборатории

2. Материал для микробиологических исследований

3. Набор помещений микробиологической лаборатории

4. Оснащение микробиологической лаборатории

5. Правила поведения и работы в микробиологической лаборатории

6. Характеристика микробов по степени опасности заражения

Уметь:

1. Пользоваться лабораторной посудой: пробирками, чашками Петри, бак.петлями, градуированными и пастеровскими пипетками, спиртовками, предметными стеклами.

Задачами микробиологической лаборатории являются:

1. Диагностика инфекционных заболеваний

2. Выявление носителей патогенных микробов

3. Исследование объектов внешней среды

4. Получение иммунобиологических препаратов

Для выполнения всех правил работы с заразным материалом и проведения исследований лаборатория должна иметь набор помещений: регистратуру, лабораторные комнаты, боксы, средоварочные, стерилизационные, моечные, комнаты отдыха, санузел. Лабораторные комнаты предназначены для проведения исследований. Они должны быть просторными и светлыми. Стены покрывают плиткой или покрывают масляной краской; пол покрывают линолеумом, столы — пластиком. Окна ориентированы на север или северо-восток. В комнатах должна быть подводка холодной и горячей воды.

Материалом для исследований чаще всего являются выделения человека: кровь, моча, мокрота, испражнения, гной, отделяемое ран и так далее. Кроме этого исследуют объекты внешней среды на содержание микробов, которые прямо или косвенно влияют на здоровье человека.

Оснащение микробиологической лаборатории:

1. Холодильник для хранения культур и сред.

2. Термостат, который служит для выращивания микробов на питательных средах

3. Суховоздушный шкаф предназначенный для стерилизации лабораторной посуды, ваты, бумаги и т. д.

4. Микроскопы, необходимые для изучения микробов в живом и окрашенном состоянии.

5. Бактерицидный облучатель для санации воздуха

6. Лабораторная посуда, наборы красок, лотки, бак.петли и т. д.

Правила поведения и работы в микробиологической лаборатории:

1. К работе допускают сотрудников только после ознакомления с правилами поведения и режимом работы.

2. Все работники подвергаются профилактическим прививкам

3. К работе допускаются лица не моложе 18 лет

4. Каждый сотрудник должен иметь халат, шапочку, сменную обувь, маску, резиновые перчатки.

5. В лабораторных комнатах запрещается курить, принимать пищу, громко разговаривать.

6. При попадании исследуемого материала на руки, халат, стол, другие объекты необходимо срочно провести дезинфекцию и сообщить вышестоящему лицу.

Режим работы в лабораториях зависит от степени опасности заражения для лиц, работающих с болезнетворными микробами. Микробы по степени опасности заражения ими разделены на группы:

1. Особо опасные - возбудитель чумы

2. Возбудители холеры, бруцеллеза, туляремии, сибирской язвы, сапа, лептоспироза

3. Возбудители брюшного тифа, дизентерии, туберкулеза, дифтерии, коклюша и т. д.

4. Сальмонеллы, протей, эшерихии, стафилококки, стрептококки, возбудители газовой гангрены и т. д.

С материалом, возможно зараженным возбудителями особо опасных инфекций (ООИ) работают в специальных лабораториях с разрешения органов здравоохранения РФ.

Методы микробиологического исследования:

1. Микроскопический

2. Бактериологический (культурный)

3. Серологический

4. Биологический

5. Аллергический

Правила работы с бактериологической петлей

1. Бак.петля состоит из петледержателя и самой бак.петли длинной 6-8 см.

2. В нерабочем состоянии простерилизованная бак.петля располагается в стаканчике (штативе) опираясь на петледержатель

3. Для работы бак.петлю берут за петледержатель, как писчее перо.

4. Стерилизуют бак.петлю в пламени горелки. Для этого собственно петлю под углом 45 градусов вводят в среднюю часть пламени, накаляют докрасна, затем для стерилизации ближнего участка к петле петледержателя, его проводят в пламени 2-3 раза.

5. Совершив необходимую манипуляцию бак.петлей (посев, пересев), её вновь стерилизуют указанным выше способом и возвращают на место, ставя петледержателем вниз.

Правила работы с чашками Петри

1. Чашка Петри предназначена для культивирования микробов на плотной питательной среде.

2. Чашка Петри состоит из крышки большего диаметра и донной части — меньшего диаметра. В донную часть вносится питательная среда

3. Хранятся чашки Петри донной частью вверх

4. При просмотре роста микробов, выросших на чашке Петри, её берут за боковые края крышки средним и указательным пальцами, указательным поддерживают донную часть. Поднимают чашку до уровня глаз, располагая на 15-20 см от глаз, донная часть чашки обращена к лицу. Таким образом, просматривают выросшие колонии в проходящем свете.

Правила работы с пробирками

1. В лабораторных пробирках происходит рост микроорганизмов на плотных или жидких средах.

2. Пробирки должны хорошо закрываться ватно-марлевыми пробками. Часть пробки должна войти в отверстие пробирки, а другая — возвышаться над пробиркой так, чтобы её удобно было захватить левой рукой, зажав между ладонной поверхностью и мизинцем.

3. Пробирки держат в левой руке, располагая между большим и указательным пальцем так, чтобы содержимое пробирки было хорошо видно.

Работа с градуированными и пастеровскими пипетками

1. Данные пипетки в работе используются стерильными, завернутыми в бумагу

2. Градуированную пипетку берут посередине одной рукой. Другой в этом месте надрывают бумагу и стягивают её с пипетки в противоположные стороны. Затем берут пипетку ближе к концу, но не дотрагиваясь до «ротовой» части пипетки и перед работой дополнительно стерилизуют, проведя 2-3 раза в пламени горелки.

3. Пастеровские пипетки и шпатели перед работой извлекают из бумаги, а которой они стерилизовались и дополнительно стерилизуют в пламени горелки.

Работа с предметными стеклами

1. Предметные стекла предназначены для приготовления мазков.

2. Подготовленные стекла хранятся в банке со смесью Никифорова.

3. Перед работой стекло извлекается пинцетом из банки и кладется на спец. мостик в лоточке.

4. Руками предметные стекла берутся только за ребра.

Занятие 2

Цели занятия:

Знать:

1. Методики приготовления мазков из патологического материала и микробных культур;

2. Способ фиксации мазков, значение фиксации;

3. Красители, применяемые в микробиологической практике

4. Методики приготовления основных и рабочих растворов красителей

Уметь:

1. Приготовить мазки из микробной культуры с жидкой и плотной питательной среды, вязкого материала, жидкого патологического материала (ликвор, моча), органов и тканей (мазки — отпечатки).

2. Провести фиксацию физическим и химическим способом

3. Приготовить рабочие растворы красителей.

Техника приготовления мазков

1. Из микробной культуры с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала:

- взять пинцетом подготовленное к работе предметное стекло; маркером обвести контур будущего мазка; закодировать мазок;

- маленькую каплю исследуемого материала или культуры нанести в центр контура мазка стерильной петлей или пастеровской пипеткой и круговыми движениями распределить ровным слоем в контуре. Мазок должен быть равномерно мутным. Мочу и ликвор предварительно центрифугируют и мазки готовят из осадка.

2. Из микробной культуры с плотной питательной средой:

- на середину подготовленного предметного стекла нанести каплю физиологического раствора петлей или пастеровской пипеткой.

- подготовленной петлей взять микробную культуру с плотной средой и внести в каплю жидкости; круговыми движениями равномерно распределить ее; диаметр мазка до 1 см.

3. Из вязкого материала: мокрота, гной:

- материал нанести на предметное стекло к одному из узких краев;

- накрыть сверху другим предметным стеклом;

- стекла прижать друг к другу за ребра;

- свободные концы стекол захватывают большим и указательным пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу; получаются два мазка-близнеца.

4. Из органов и тканей:

- поверхность органа прижигают накаленным пинцетом, делают по этому месту разрез и из глубины стерильными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами, поступая далее, как при приготовления мазков из гноя.

- если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают соскоб скальпелем, который распределяем тонким слоем по поверхности стекла скальпелем.

Приготовленные мазки высушивают при комнатной температуре, а затем фиксируют. Фиксация применяется с целью:

• прикрепления мазка к стеклу;

• уничтожения культуры в мазке и тем самым обеспечивая безопасность дальнейшей работы;

• лучшего восприятия красителей клетками микробов.

Фиксация бывает физическая и химическая.

1. Физическая фиксация: взять предметное стекло с мазком за ребра ближе к концу и медленно провести 3 раза через пламя спиртовки. Для контроля фиксации стекло приложить к тылу кисти. Должны ощущать легкое жжение.

2. Химическая фиксация: используются химические вещества: метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, ацетон т. д. Мазок погружают в стаканчик с фиксатором или сверху на мазок наносят фиксатор. Время фиксации 5-20 минут. Так чаще фиксируют мазки из патологического материала.

Зафиксированный мазок называется препаратом.

Окраска препарата

Красители, используемые в микробиологической практике, представлены амфорными или кристаллическими порошками. По цвету бывают: красные (фуксин, нейтральный красный), синие (метиленовый синий), фиолетовые (генцианфиолет, кристаллфиолет), желто-коричневые (везувин, христоидин), зеленые (малахитовый, бриллиантовый). Из этих красителей первоначально готовят спиртовые растворы по прописи 1:10 (1 часть красителя, 10 частей этилового спирта). Смесь помещают на 24 часа в термостат при 37ºС. Затем фильтруют. Спиртовые растворы красителей хранят в склянках из темного стекла длительный срок. Из них готовят рабочие растворы красителей. Сейчас централизовано готовят наборы красок для окраски по Граму, Цилю-Нильсену, Ожешко, Бурри-Гинсу.

Рецепты красителей

Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микробов, спор и капсул):

насыщенного спиртового раствора фуксина — 10 мл.

5% раствора карболовой кислоты — 9 мл.

Фуксин Пфейффера (для окраски микробов по Грамму и для простого метода окраски)

фуксин Циля — 1 мл.

дистиллированной воды — 9 мл.

Отношение микробов к красителям называется тинкториальными свойствами.

Занятие 3

Микроскопический метод исследования. Простые и сложные способы окраски.

Знать:

1. Сущность микроскопического метода исследования;

2. Виды микроскопирования, их характеристики;

3. Устройство микроскопа «Биолам»;

4. Правила работы и ухода за микроскопом;

5. Простые способы окраски, их значение;

6. Сложные способы окраски, их значения;

7. Окраска по Граму.

Уметь:

1. Приготовить препарат микробной культуры, окрасить простым и сложным способом;

2. Провести иммерсионную микроскопию; зарисовать.

Микроскопический метод исследования применяют для изучения окрашенных и не окрашенных препаратов. Он позволяет изучить тинкториальные свойства, отношение к окраске, морфологию клеток: внешний вид клетки, наличие спор, капсул, жгутиков; подвижность и взаиморасположение клеток: попарно, цепочкой, хаотично и т. д.

Виды микроскопии:

1. Световая (изучает микроорганизмы размером не более 0,2 мкм)

2. Электронная (изучает микроорганизмы размером менее 0,2 мкм)

Виды световой микроскопии:

1. Иммерсионная микроскопия — применяется для изучения окрашенных препаратов с объективом 90 и выше.

2. Фазово-контрастная — применяется для изучения неокрашенных препаратов. Глаз человека способен различать длину световой волны (цвет, интенсивность, яркость), но не может обнаружить различия в фазе преломления. При изучении неокрашенных микробов, которые отличаются от окружающей среды только по показателю преломления, на рассматриваемом фоне при обычной микроскопии их не увидеть. Поэтому для изучения микроорганизмов в неокрашенном виде, используют фазово-контрастную микроскопию. Для этого есть фазово-контрастные устройства, которые можно установить на любой микроскоп. Устройство состоит из специального объектива и конденсора с поворачивающим диском. Настройка заключается в следующем: заменить обычный объектив на фазово-контрастный, заменить конденсор. Видим: на темном фоне микроорганизмы светлые — негативный препарат, или на светлом фоне — микроорганизмы темные — позитивный препарат. Но не все микроорганизмы можно изучить при данной микроскопии; например, лептоспиры, вирус изучают при темнопольной микроскопии.

3. Темнопольная микроскопия. Она основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для данной микроскопии используют обычные объективы, но специальные темнопольные конденсоры, у которых центральная затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не поступают. Объект освещается косыми боковыми лучами, и в объектив попадают лучи, рассеянные частицам, находящимися в препарате. Видим: якро-светящиеся микроорганизмы на темном поле. Настройка: установить свет; заменить светлопольный конденсор на темнопольный; на верхнюю линзу конденсатора нанести иммерсионное масло и поднять конденсор до соприкосновения нижней поверхностью предметного стекла; объектив 8 фокусируют на препарат; с помощью центровочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно; поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения яркого пятна — должно быть равномерное освещение; затем устанавливают объектив 40 и исследуют объект.

4. Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светится при освещении их УФЛ или синим светом. При освещении синим светом свечение от зеленого до красного цвета. Под влиянием УФЛ свечение любого цвета. Алгоритм люминесцентной микроскопии: приготовить мазок, высушить, зафиксировать; окрасить растворами люминесцирующих красителей — хлюорохромами, которые избирательно взаимодействуют с определенными структурами клетки. Флюорохромы отличаются от обычных красителей тем, что используются в очень малых концентрациях и ии могут быть окрашены фиксированные и живые клетки. Вариант данной микроскопии — РИФ — реакция иммуно-флюоресценции — используется для экспресс-диагностики.

Способы окраски

Простой способ окраски. Использование одного вида красителя:

1. Растворы метиленового синего, время окраски 3-5 минут

2. Растворы фуксина, время окраски 1-2 минут

3. Растворы бриллиантового зеленого, время окраски 3-5 минут

Данный способ прост в работе, позволяет изучить форму клетки микроорганизмов, взаиморасположение.

Сложные способы окраски позволяют выявить определенные структуры микроорганизмов (капсулы, споры, жгутики, нуклеотид), провести дифференциацию видов микроорганизмов (Грам плюс и Грам минус кислотоустойчивые и некислотоустойчивые). При окраске сложным способом используют 2-3 красителя, протраву, дифференцирующее вещество.

Окраска по Граму

Дифференциация микроорганизмов на Грам положительные и Грам отрицательные основано на различии строения клеточной стенки. У Грам положительных микроорганизмов в клеточную стенку входит многослойный пептидогликан, с которым связаны тейхоевые кислоты. Этот комплекс образует прочное соединение с генцианвиолетом, не разрушающееся при воздействии спирта 96º.

У Грам отрицательных микроорганизмов пептидогликан однослойный, тейхоевых кислот мало, больше фосфолипидов и липопротеидов, что создает непрочное соединение с генцианвиолетом, окрашиваясь дополнительным красителем — фуксином. Используемые красители: карболово-спиртовой генцианвиолет, фуксин Пфейффера. Протравка — раствор Люгеля. Дифференцирующее вещество — 96º этиловый спирт.

Грам положительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет — стафилококки, стрептококки, пневмококки.

Грам отрицательные окрашиваются в малиновый цвет — менингококки, гонококки.

Этапы окраски

1. На препарат кладут фиолетовую бумажку по Синёву и сверху наносят несколько капель физраствора. Окрашивают 1-2 мин.

2. Снять пинцетом бумажку с препарата, слить в лоток избыток краски

3. Не промывая препарат водой, нанести несколько капель раствора Люголя и держать до почернения препарата примерно 1 минуту.

4. Не промывая препарат водой, нанести сверху раствор 96º этилового спирта; держать до отхождения красителя

5. Промыть физраствором или стерильной дистиллированной водой

6. Д окрасить фуксином Пфейффера — 3 минуты

7. Промыть физраствором или стерильной дистиллированной водой.

Самостоятельная работа:

1. Приготовить 2 препарата из микробной культуры.

2. Окрасить простым способом (м/с) и сложным по Граму

3. Провести иммерсионную микроскопию, зарисовать.

Занятие №4 «Изучение шаровидных форм бактерий. Окраска по Бури-Гинсу и Ожешко»

План занятия

1. Морфологические особенности шаровидных форм бактерий.

2. Тинкториальные свойства шаровидных форм бактерий

3. Окраска по Бурри-Гинсу и Ожешко

Знать

1. Морфологические структуры, размеры шаровидных форм бактерий

2. Микроскопию шаровидных форм

3. Методики окраски по Бурри-Гинсу и Ожешко

Уметь

1. Провести микроскопию демонстрационных препаратов шаровидных форм бактерий, зарисовать

2. Приготовить препарат из капсульных бактерий, окрасить по Бурри-Гинсу

3. Провести микроскопию, зарисовать

4. Приготовить препарат из споровой культуры, окрасить по Ожешко, провести микроскопию, зарисовать.

Шаровидные бактерии — кокки имеют средний диаметр около 1 мкм. В зависимости от их расположения в мазке, что определяется характером деления клеток, патогенные кокки подразделяются на локки (двойной), стрептококки (цепочечный) и стафилококки (виноградная гроздь). Диплококки и стрептококки делятся в одной плоскости, но остаются соединенными цитоплазматическими мостиками. К диплококкам относятся:

1. Пневмококки — диплококки ланцетовидной формы

2. Менингококки — диплококки бобовидной формы

3. Гонококки — диплококки бобовидной формы.

Стафилококки делятся в двух плоскостях и образуют скопления клеток, напоминающие грозди.

Непатогенные кокки располагаются беспорядочно (микрококки) тетрадами и пакетами по 8-16 особей (сарцины). Тетракокки и сарцины делятся в двух-трех плоскостях.

Спор и жгутиков патогенные кокки не образуют. Капсулы имеют только некоторые кокки, например пневмококки.

Тинкториальные свойства.

Гр +: стафилококки, стрептококки, пневмококки

Гр -: менингококки, гонококки

Морфологические значения клетки

Наименование	Наличие	Значение	Способ выявления
Нуклеотид	+	Носитель генетической информации	По Гинсу
Клеточная стенка	+	Защитная в макроорганизме	По Гинсу
Капсула	+ -	Защитная в макроорганизме	По Гинсу
Жгутики	-	Органы движения	По Ожешко
Споры	-	Защитное во внешней среде	По Ожешко

Алгоритм окраски по Бурри-Гинсу

1. На предметное стекло (ближе к узкому краю) нанести каплю черной туши, разведенной в 10 раз.

2. В нее внести каплю культуры, перемешать две капли

3. Ребром шлифовального стекла сделать мазок, так же как и мазок крови

4. Высушить на воздухе

5. Зафиксировать химическим способом

6. Осторожно промыть водой

7. Окрасить фуксином Пфейффера — 3-5 минут

8. Осторожно промыть водой, высушить на воздухе.

Фильтровальной бумагой для высушивания препарата не пользоваться, не повредить препарат.

Микроскопия иммерсионная. Видим: фон препарата черный, клетки красные, капсулы не окрашены, в виде бесцветного ореола вокруг клетки.

Алгоритм окраски по Ожешко

1. На высушенный на воздухе мазок налить несколько капель 0,5% р-ра хлороводородной кислоты.

2. Подогреть до образования паров

3. Высушить и зафиксировать над пламенем спиртовки

4. Фиксировать препарат покрыть фильтровальной бумагой и нанести фуксин Циля

5. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогреть над пламенем спиртовки до отхождения паров. Добавляя красителя подогреть 2-3 раза

6. После охлаждения препарата снять бумажку и промыть водой.

7. Препарат обесцветить 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор

8. Промыть водой

9. Окрасить водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-4 минут

10. Промыть водой, высушить

11. Микроскопия иммерсионная. Споры — красные, клетки — синие.

Микроскопия позволяет определить:

1. Морфологические свойства

2. Тинкториальные свойства

Изучение палочковидных и извитых форм бактерий

План занятия:

1. Характеристика палочковидных и извитых форм бактерий.

2. Окраска препаратов по Ожешко и Цилю-Нильсену.

Знать:

1. Биологические особенности палочковидных и извитых форм бактерий

2. Методики окраски сложными методами по Ожешко и Цилю-Нильсену.

3. Методики определения подвижности микроорганизмов.

Уметь:

1. Провести микроскопию демонстрационных препаратов палочковидных и извитых форм бактерий, зарисовать микроскопическую картину.

2. Приготовить препарат из споровой культуры, окрасить по Ожешко, зарисовать микроскопическую картину.

3. Приготовить препарат и ВЦЖ, окрасить по Цилю-Нильсену, зарисовать микроскопическую картину.

4. Приготовить препараты «раздавленной» и «висячей» капли, провести микроскопию, зарисовать микроскопическую картину.

Палочковидные бактерии весьма разнообразны по форме. Среди них встречаются прямые, изогнутые, ветвистые. Большинство патогенных микроорганизмов имеют овоидную форму. Исключение составляют цилиндрические палочки возбудителя сибирской язвы, веретенообразные микобактерии туберкулеза. Длина наименьших коккобактерий колеблется от 0,2 до 1,5 мкм, а самых больших от 5 до 10 мкм. Располагаются палочки беспорядочно, попарно в длину, параллельно, под углом друг к другу, цепями. Многие виды патогенных бактерий имеют жгутики и капсулы. Споры образуют бациллы (аэробы) и клостридии (анаэробы). Встречаются Грам положительные и Грам отрицательные. К известным бактериям относятся спириллы, вибрионы, спирохеты.

Морфологический компонент	Его наличие	Значение
Нуклеоид	+	Носитель генетической информации
Клеточная стенка	+	Защитная, формообразующая
ЦПМ	+	Транспорт питательных веществ
Рибосомы	+	Синтез белка
Аппарат Гольджи	-	-
Споры	+ -	Защита от внешних условий
Эндоплазматическая сеть	-	-
Капсула	+ -	Защита от иммунной системы

Наличие в бактериальной клетке жиро-восковых веществ обеспечивает ее кислото-, щелоче-, спиртоустойчивость.

Окраска по Цилю-Нильсену

Сложный способ окраски, дифференцирующий бактерии на кислотоустойчивые и некислотоустойчивые.

1. На фиксированный мазок нанести карболовый фуксин Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в теч. 3-5 минут.

2. Снять бумагу, промыть препарат водой.

3. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси 96º этилового спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин. Для обесцвечивания.

4. Промыть водой

5. Докрасить препарат водным раствором метиленового синего в теч. 3-5 мин.

6. Промыть водой. Высушить.

Микроскопия иммерсионная. Видим кислотоустойчивые бактерии окрашены в красный цвет, некислотоустойчивые в голубой цвет. Данный способ окраски применяют для обнаружения возбудителя туберкулеза в исследуемом материале.

Определение подвижности микроорганизмов

1. Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают её покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат под объективом 40, без иммерсионного масла, конденсор опущен. Вначале под объективом 8 находим край капли, а затем устанавливаем объектив 40 и исследуем препарат.

2. Метод «висячей» капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят каплю бактериальной культуры. Затем покровное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Под объективом 8 находим край капли, а затем устанавливают объектив 40 и исследуют препарат без иммерсионного масла, при опущенном конденсоре.

Прижизненная (витальная) окраска

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного (можно тушь, разведенную 1:10). Затем готовят препарат «висячей» или «раздавленной» капли. Микроскопию проводят при объективе 40, без иммерсионного масла, при опущенном конденсоре. После микроскопии препараты поместить в дез. раствор.

Занятие №6

Тема «Дезинфекция»

План занятия:

1. Антимикробное действие физических и химических факторов.

2. Асептика, антисептика, дезинфекция.

3. Антисептики, дезинфектанты

4. Дезинфекция отработанного биоматериала, микробных культур, объектов внешней среды.

5. Методы контроля эффективности дезинфекции

Цель: усвоив данный материал студент должен уметь готовить дезрастворы разной концентрации, проводить дезинфекцию адекватными методами.

Знать:

• характеристику физических и химических факторов, действующих на микроорганизмы

• сущность асептики, антисептики, дезинфекции

• виды дезрастворов, их характеристика

• методики приготовления дезрастворов разной концентрации

• методики дезинфекции конкретных объектов, встречаемых в микробиологической практике.

Жизнь микроорганизмов проходит под влиянием физических факторов внешней среды (температуры, влажности, ионизирующей радиации, ультразвука). Антимикробное действие температурного фактора зависит от биологических особенностей микроорганизмов, от формы их существования: вегетативная или споровая. Так вегетативные формы мезофиллов погибают при нагревании до 60º в течение 30-60 минут. Споровые формы устойчивы и погибают в течение 1 часа при 1,5 атм. Или 180º — 30 мин (суховоздушный способ). При высоких температурах происходит денатурация белка микробных клеток. При низких температурах многие микроорганизмы остаются жизнеспособными, впадая в анабиоз и временно прекращая свою активность (сохранение пищевых продуктов в холодильниках). Высушивание приводит к обезвоживанию клетки с развитием губительных необратимых процессов для нее. Это применяется при изготовлении биопрепаратов, иммунных сывороток, вакцин и т. д. Применяют лиофильную сумку: объект замораживают, затем высушивают в вакууме.

Ионизирующая радиация:

а) УФЛ — инактивируют ферменты клеток, ДНК. Применяют для санации боксов, рабочих комнат

б) альфа-бета-гамма лучи применяют для обеззараживания полистироловой лабораторной посуды, стерилизации ее шовного материала. Данные лучи разрушают ядерные структуры и ДНК.

Ультразвук — повышает внутриклеточное давление за счет активации газа внутри клетки, что приводит к разрыву клеточной оболочки. Используют для стерилизации молока, соков, воды.

Химические факторы

Влияние химических факторов на микроорганизмы зависит от природы фактора, концентрации, продолжительность воздействия. В зависимости от концентрации химических веществ может оказать положительное или губительное действие на микроорганизм. Например 2% раствор глюкозы стимулирует рост микроорганизмов, а 21-40% раствор угнетает размножение. Многие химические вещества, оказывающие губительное действие на микроорганизмы используются в медицинской практике в качестве дезинфицирующих растворов и антисептиков. Химические вещества вызывают денатурацию белка микробной клетки, повреждают оболочку, влияют на ДНК и т. д.

Асептика

Это система мероприятий, предупреждающих попадание микроорганизмов из окружающей среды в ткани или полости организма человека при лечебных и диагностических манипуляциях, а также в материал для исследования, в питательные среды, в микробные культуры — при лабораторных исследованиях. Она достигается: стерилизацией инструментов и материалов, специальной обработкой рук медицинских работников, соблюдением особых микробиологических правил и приемов работы.

Антисептика

Комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов способных вызвать инфекционный процесс на поврежденных участках кожи, слизистых оболочках.

Дезинфекция

Комплекс мероприятий, направленной на уничтожение патогенных микроорганизмов на объектах окружающей среды. Подразделяется на текущую и заключительную. Текущая дезинфекция проводится на протяжении всего дня по ходу работы, а по окончании работы — заключительная.

Методы дезинфекции:

а) физический: автоклавирование, сжигание, кипячение, применение УФЛ, ионизирующей радиации

б) химический: применение дезрастворов

в) биологический: применение антибиотиков

г) комбинированный: сочетание физического метода с химическим (кипячение с 2% раствором соды)

Антисептики:

а) 70º этиловый спирт

б) 5% спиртовой раствор йода

в) 1-2% спиртовые растворы метиленового синего или бриллиантового зеленого

г) 0,1% раствор перманганата калия

д) перекись водорода, раствор фурацилина и т.д.

Дезинфектанты, основные группы:

1. Галлоидосодержащие (хлорсодержащие, йодсодержащие вещества)

2. Кислородсодержащие (перекись водорода)

3. Производные надуксусной и надмуравьиной кислот («Медилокс», «Сайдекс-нью)

4. Четвертичноаммониевые соединения («Дюльбак», «Септодор», «Септабак»)

5. Третичноаммониевые соединения («Алминол», «Инцидин экстра Н»)

6. Гуанидины — производные хлоргексидина биглюканата, используются как кожные антисептики («Литазол», спиртовой раствор хлоргексидина).

7. ПАВ - поверхностно-активные вещества («Айна», «Лотос», «Прогресс»).

8. Альдигидсодержащие (формалин, «Сайдекс», «Гигасепт», «Бианол»)

9. Спирт и производные спиртов («Иосепт», «Лизанин»)

10. Фенолсодержащие соединения («Амоцид»).

Среди галлоидосодержащих веществ чаще применяются хлорсодержащие препараты — хлорная известь — сухая или 0,1% раствор, хлорама — 0,5%-5% раствор, ДТСГК — двухтретьосновная соль гипохлората кальция — 0,1-10% раствор, активированный хлорамин. Все препараты обладают широким спектром антимикробного действия. Недостатки: вызывают коррозию, обесцвечивание ткани, раздражение ВДП.

Новые дезинфектанты

1. Сагросепт - для дезинфекции рук. 3 мл раствора нанести на кисти рук и втирать до 2 минут

2. Виркон — обладает бактерицидным и фунгицидным действием. Применяется для дезинфекции поверхностей оборудования. Используют раствор, контакт — 10 минут. При сильном загрязнении: смочить салфетку 2% раствором и приложить к загрязненному месту на 10 минут.

3. Хлорсепт — таблетки, гранулы, для дезинфекции биоматериала, кроме мочи. Объект засыпают впитывающими гранулами, слить в канализацию.

4. А-33 — средство, применяемое при вирусных инфекциях, СПИДе. Выпускают в пакетах. 1 пакет на 4,5 литров воды.

Дезинфекция биоматериала

1. Моча — слить в специальную емкость с делениями и засыпать сухой хлорной известью из расчета 1:5 и выдержать 60 минут, слить в канализацию.

2. Кровь, сыворотка — собрать в закрытую маркированную емкость с делениями. Долить воду до метки и засыпать сухой хлорной известью из расчета 1:5 на 60 минут (200г препарата на 1 литр смеси).

3. Кал — собрать в закрытую маркированную емкость с делениями. До метки долить воды и засыпать сухой хлорной известью из расчета 1:5 на час (200г препарата на 1 литр).

Лабораторную посуду, где хранится биоматериал в процессе проведения исследования кипятят в мыльном растворе 30 минут, ополаскивают, сушат. Можно дезинфицировать погружением в 3% раствор хлорамина на 60 минут.

Дезинфекция отработанных микробных культур

Дезинфекция отработанных культур микроорганизмов, выращенных в пробирках, колбах, чашках Петри проводится физическим методом — автоклавированием. Предварительно из пробирок, колб, флаконов извлекают пробки и укладывают в кастрюли, бачки, ведра и т. п. Чашки Петри помещают в дистиллированную воду с добавлением 2% соды и кипятят 1 час.

Градуированные пастеровские пипетки, шпатели, пинцеты, корнцанги сразу после работы с инфицированным материалом погрузить в емкости с дезраствором (3% хлорамин) не менее чем на 1 час.

Лабораторный инструментарий, имеющий контакт с кровью, сывороткой (предметные стекла, резиновые баллоны, наконечники, плашки, градуированные пипетки, пастеровские пипетки):

1. Промыть в воде, налитой в специальную емкость. Промывную воду кипятят 30 минут или засыпают сухую хлорную известь (200г на 1 литр), перемешать, выдержать 60 минут, слить в канализацию

2. Промытые изделия прокипятить в закрытой емкости 30 минут в дистиллированной воде или 15 минут в 2% растворе соды

Можно продезинфицировать химическим методом: 3%хлорамин, 6% перекись водорода на 60 минут.

Дезинфекцию проводить в резиновых перчатках!!!

Спецодежда — обработать дезраствором участок инфицирования (Виркон, 3% хлорамин), затем снять и целиком замочить в дезрастворе не менее часа, выстирать.

Смену спецодежды производить не реже 2 раз в неделю.

Перчатки — проверяют их целостность. Для этого необходимо надуть перчатку и погрузить в воду. После работы снять и погрузить в дезраствор на 1 час (6% перекись водорода, 3% хлорамин), можно прокипятить 30 минут. Руки после снятия перчаток продезинфицировать: 70% этиловый спирт, карболовое мыло, промыть под проточной водой. Если во время работы порвали перчатку, не травмируя кожу — ее снять, погрузить в дезраствор, продезинфицировать руки, надеть другие перчатки, проверенные на целостность или одноразовые. Если порвали перчатку с травмированием кожи необходимо: снять перчатку, выдавить кровь из раны, обработать рану 70% этиловым спиртом, обработать края ранки 5% раствором йода, заклеить лейкопластырем, надеть целую перчатку.

Рабочий стол — поверхность стола следует протереть ветошью, смоченной 5% хлорамином. Использованная ветошь дезинфицируется тоже в 3% хлорамине не менее 1 часа, затем можно выбрасывать. При использовании 70% этилового спирт, поверхность стола следует протереть 3-5 раз.

При попадании биоматериала на кожу её обрабатывают проточной водой, а затем 70% этиловым спиртом.

При попадании крови на слизистую глаза их обрабатывают раствором марганцовокислого калия в разведении 1:10000.

При дезинфекции рук — нельзя пользоваться общим куском мыла, необходимо жидкое; нельзя протирать руки после дезинфекции общим полотенцем необходимо бумажное.

Каждая лаборатория должна иметь аптечку АнтиСПИД, куда входят:

• ножницы

• 5% спиртового р-р йода

• 70º раствор этилового спирта

• перевязочный материал

• дистиллированная вода

• стакан

Методы контроля дезинфекции

1. Химический — запаянные ампулы с серой, сахарозой, бензойной кислотой. Используют при автоклавировании. При достижении нужной температуры содержимое ампул плавится.

2. Биологический — нити, смоченные вегетативной и споровой культурой, помещают в пробирки с бульоном и подвергают дезинфекции вместе с другим материалом. Затем посевы выдерживают в термостате при 37º 24 часа. Если дезинфекция проведена эффективно, то роста в пробирках не будет.

3. Контроль антимикробного действия антисептических и дезинфицирующих веществ:

а) шелковые нити смочить вегетативной и споровой культурой

б) смоченные нити поместить в 5% раствор фенола, 3% раствор хлорамина, раствор хлорной извести на 60 минут. Отмыть стерильным физраствором.

г) засеять в питательный бульон и поместить в термостат до следующего дня. Роста микроорганизмов не должно быть.

Контрольные тесты, не подвергают действию дезрастворов, рост микроорганизмов должен быть.

Стерилизация

Знать:

• сущность определения «стерилизация»

• методы стерилизации

• виды стерилизации, их особенности, диапазон применения

• эталоны качества стерилизации

Уметь:

• подготовить посуду к стерилизации — чашки Петри, пробирки, пипетки, колбы, флаконы к стерилизации

• провести стерилизацию суховоздушным способом.

Стерилизация — освобождение различных объектов от всех форм жизни (полное обеспложивание). В микробиологической практике стерилизации подвергают: инструменты, посуду, питательные среды, бумагу, вату, спецодежду. Стерилизуемый объект должен быть подготовлен к стерилизации. Например посуда должна быть чистой, обезжиренной.

Методы стерилизации:

1. Тепловая (использование температурного фактора)

2. Холодная (ионизирующее радиация, УФЛ, газовая стерилизация, фильтрование).

Тепловая стерилизация, ее виды.

1. Фламбирование — прокаливание на огне (спиртовки) — дает эффект полного обеспложивания (от вегетативных и споровых форм). Стерилизуем — мелкий инструментарий (пинцеты, ножниц, металлические шпатели), бак.петли, стекла препаратов, иглы. Помнить! Режущие поверхности инструментов (ножницы, скальпели) тупятся, поэтому часто пользоваться этим видом стерилизации в данном случае нельзя.

2. Кипячение — стерилизация неполная: возможно сохранение на стерильном объекте термостойких споровых форм, вирусов. Стерилизуем: шприцы, иглы, мелкий инструментарий, предметные и покровные стекла, резиновые изделия. Стерилизацию проводят в стерилизаторах. Перед стерилизацией в стерилизатор налить дистиллированную воду с 1-2% бикарбоната натрия, уложить стерилизуемый материал — шприцы в разобранном виде, в иглы вставить мандрены, режущие поверхности инструментов обернуть марлей. Закрыть крышку стерилизатора, включить электроканал. Время стерилизации засекаем с момента закипания воды в стерилизаторе — выход пара наружу. Стерилизуем не менее 30 минут.

3. Стерилизация паром под давлением — универсальный вид, дающий полное обеспложивание. Стерилизуем в автоклавах (горизонтальных, вертикальных). На стерилизуемый объект действуем двумя физическими факторами: температура, пар под давлением, между которыми есть зависимость:

Давление в стерилизационной камере (по манометру на корпусе автоклава)	Температура в стерилизационной камере
0 атм.	100⁰С
0,2 атм.	105⁰С
0,5 атм.	112⁰С
1 атм.	120⁰С
1,5 атм.	127⁰С
2 атм.	134⁰С

Составные части автоклава:

- стерилизационная камера

- манометр

- предохранительный клапан

- воронка для воды

- кран для выпуска воды

- кран для выпуска пара

Стерилизуемый материал помещают в биксы, пеналы, затем в стерилизационную камеру, которая плотно закрывается массивной крышкой, накладываемой на резиновую прокладку и завинчивающейся «барашками». Стерилизовать автоклавированием можно различные объекты при различных режимах:

- простые питательные среды, перевязочный материал, физраствор стерилизуют при 1 атм. 20-30 минут.

- среды с углеводами — 0,5 атм, 15-20 минут

- обеззараживание инфицированного материала — 1,5 — 2 атм. - 20-25 минут и т. д.

Контроль за уровнем температуры в стерилизационной камере, т. е. за правильностью показаний манометра осуществляется о помощью различных веществ, имеющих определенные точки плавления: антипирин 113⁰С, резорцин и сера 119⁰С, бензойная кислота 120⁰С. Эти вещества смешивают с малым количеством красителя (фуксина или метилленовой сини) и запаивают в стеклянные трубочки, которые помещают в вертикальном положении между стерилизуемым материалом. Если температура достаточна, вещество плавится и окрасится в цвет красителя. Для контроля качества стерилизации используют бульонные культуры — вегетативные или споровые, в зависимости от режима работы автоклава. Культуры помещают в биксы, пеналы вместе со стерильным материалом. После стерилизации вскрывают один бикс, извлекают пробирку, помещая затем в термостат при 37⁰С на 24-48 часов. Отсутствие роста свидетельствует о правильной работе прибора.

4. Суховоздушная стерилизация: использование сухого горячего воздуха. Проводится в суховоздушных стерилизаторах, используя два режима: 180⁰С 60 минут и 160⁰С 150 минут. Указанные режимы рекомендованы для изделий из металла, стекла, силиконовой резины. Стерилизация полная. Стерилизуемые объекты заворачивают в бумагу (лабораторную посуду), или помещают в бумажные мешочки. (Бумага влагопроточная, для упаковки продукции марки &). Срок сохранения стерильности трое суток.

5. Стерилизация текучим паром в автоклаве или аппарате Коха — дробная стерилизация. Стерилизуют объекты, не выдерживающие высоких температур (меньше 100⁰С). Например, среды с углеводами, желатином, молоком. Стерилизуют материал при 100⁰С в течение 30-60 минут три дня подряд. При данной температуре погибают вегетативные формы бактерий. Оставшиеся споры прорастают в вегетативные формы в промежутках между повторными прогреваниями и уничтожаются при последующих прогревах. Стерилизуют в автоклаве при не завинченной крышке стерилизационной камеры и открытом выпускном кране.

6. Стерилизация и свертывание Коха — дробная, полная. Свертыватель Коха — плоский металлический ящик с двойными стенками, покрытый теплоизоляционным материалом. В пространство между стенками через специальное отверстие наливают воду. Свертыватель Коха используют для свертывания сывороточных и яичных сред. Пробирки со средами укладывают на дно свертывателя в наклонном положении. Закрывают аппарат крышкой, включают нагрев. Работает на двух режимах: - при температуре 90⁰С 60 минут однократно, при температуре 80-85⁰С 60 минут три дня подряд.

7. Тиндализация — дробная стерилизация при 56-58⁰С в течение часа 5-6 дней подряд на водяной бане и в специальных приборах с терморегуляторами. Стерилизуют белковые жидкие среды, сыворотку, витамины.

8. Пастеризация — стерилизация при 65-70⁰С в течение 1 часа. Стерилизация неполная, уничтожающая вегетативные формы. Пастеризуют соки, вина, пиво, молоко и другие продукты.

Холодная стерилизация

1. Стерилизация ионизирующим излучением. Проводится γ-лучами в γ-установке (источник радиоактивности изотоп кобальта 60). Стерилизуют пластмассовую посуду, лабораторную посуду, шприцы одноразового использования, лекарственные вещества.

2. Стерилизация УФЛ — источник УФЛ — ртутно-кварцевые лампы. УФЛ вызывают гибель вегетативных клеток и спор. Стерилизуют воздух в ЛПУ, боксы в микробиологических лабораториях, посуду. Используют бактерицидные лампы (БУВ-15, БУВ-30) с длинной волны УФЛ 260-300 мкм.

3. Газовая стерилизация проводится окисью этилена, или смесью окиси этилена и бромистого этила в газовом стерилизаторе. Стерилизуют пластмассовую посуду, инструментарий, кетгут.

4. Фильтрование проводится с помощью бактериальных фильтров из различных пористых материалов. Стерилизация неполная, так как в фильтре могут оказаться вирусы, которые проходят через поры бактериальных фильтров. Стерилизуют питательные среды, содержащие белок, сыворотку, витамины, а также отделяют бактерии от вирусов, фагов, экзотоксинов.

Фильтры:

1. Зеутца-диски из смеси асбеста с целлюлозой. Толщина 3-5 мм, диаметр 35-140 мм. Бывают марки «Ф» - фильтрующие, задерживающие взвешенные вещества и «СФ» - стерилизующие, задерживающие бактерий.

2. Мембранные — из нитроцеллюлозы, диски белого цвета диаметром 35 мм, толщиной 0,1 мм. В зависимости от диаметра пор их обозначают № 1, 2, 3, 4, 5. Для стерилизации фильтр №1 — 0,35 мкм.

3. Фильтры-свечи: Шамберлана — полый цилиндр с дном, изготовленный из каолина с примесью песка и кварца. Стандартизируют их по размерам пор: L₁...L₂...L₃ и т. д. Беркефельда — из инфузорной земли. По величине пор их обозначают «V» - 3-4 мкм, «N» - 4-7 мкм, «W» - 8-12 мкм.

2 Семестр. Лекция 1. Бактериологические методы исследования

Для определения рода возбудителя используется микроскопический метод исследования. Определяются морфологические и тинкториальные свойства. Культуральные, антигенные, ферметативные, алергенные свойства, позволяющие определить вид бактерии выявляются бактериологическими методами — посевы, биохимия, серология, аллергический методы.

Организация рабочего места для проведения бактериологического исследования

Для организации рабочего места при проведении бактериологического исследования необходимо приготовить: спецодежду (халат, шапочку, перчатки), емкости с дезраствором для дезинфекции перчаток, ветоши, отработанных шпателей, пипеток, спиртовку, бакпетли, стерильные чашки Петри, стерильные пробирки с пробками, готовые питательные среды.

Соблюдение дезрежима и техники безопасности

1. Дезинфекция отработанного материала: отработанный биоматериал собирают в специальные емкости, засыпают сухой хлорной известью из расчета 1:5, перемешивают, закрывают крышкой, оставляют на 1 час.

2. Дезинфекция резиновых перчаток: снять перчатки, поместить в емкость с дезинфектантом, допущенным к применению в КДЛ ЛПУ, углубить, закрыть крышкой, оставить на 60 минут.

3. Дезинфекция рук: ватный шарик смочить 1% раствором хлорамина (70% этиловым спиртом или другим дезинфектантом, допущенным к использованию в ГКБ). Протереть шариком сначала левую руку в следующей последовательности: тыл кисти, ладонная поверхность, межпальцевые пространства, ногтевые ложа. Затем в такой же последовательности обработать правую руку другим шариком, смоченным дезинфектантом.

4. Обработка глаз при попадании биоматериала: промыть водой, закапать альбуцид и промыть раствором перманганата калия в разведении 1:10 000.

Простые питательные среды

Знать:

1. Требования к питательным средам

2. Классификация питательных сред

3. Стерилизация питательных сред

Уметь:

1. Приготовить питательные среды

2. Определить pH среды

3. Разлить питательные среды в чашки, пробирки, флаконы

Для выделения бактерий из исследуемого материала (кал, моча, кровь, мокрота, слизь, гной и др.) используют питательные среды. На питательных средах бактерии питаются, дышат, растут и размножаются.

Требования к питательным средам

1. Содержат все питательные вещества, необходимые для жизни бактерий (белки, жиры, углеводы, витамины, микроэлементы)

2. Имеют оптимальную pH — для большинства бактерий pH 7,2-7,4 (за исключением холерного вибриона и палочки Коха — pH 9,0 и 6,5)

3. Имеют оптимальную влажность (свежеприготовленные среды)

4. Изотоническое состояние (осмотическое давление среды должно быть такое же, как внутри бактериальной клетки)

5. Стерильность

6. Посуду для приготовления питательных сред категорически запрещается обрабатывать дезрастворами. Только автоклав или кипячение.

Классификация питательных сред:

По исходным компонентам:

1. Натуральные (мясо-пептонный агар, сыворотка, кровь, молоко и др.)

2. Синтетические (из химических органических и неорганических соединений)

По консистенции:

1. Жидкие (бульоны)

2. Плотные (агаровые — 1 и 2% и безагаровые — свернутая сыворотка, яичные среды)

3. Полужидкие (0,5% агар)

По назначению:

1. Основные — для выращивания большинства бактерий. Простые (мясо-пептонные) и сложные (содержащие кровь, сыворотку, желчь и др. компоненты)

2. Элективные — для выделения определенного вида бактерий (солевой агар, щелочной агар)

3. Дифференциально-диагностические среды — для определения биохимической активности (кровяной агар, желтковый агар)

4. Накопительные (жидкие, среды обогащения) среды — селенитовый бульон, желчный бульон.

5. Консервирующие среды — для транспортировки и хранения исследуемого материала — глицериновая смесь, фосфатный буфер.

Приготовление питательных сред

Исходным сырьем для приготовления натуральных питательных сред служат продукты животного и растительного происхождения: мясо, молоко, яйца, картофель, костная и рыбья мука, а также сгустки крови, плацента, казеин. Исходные продукты варят, получая бульон (мясо-пептонный бульон). Полученный бульон осветляют, фильтруют, определяют pH с помощью индикаторной бумаги и pH-метра. Доводят до нужной pH добавляя щелочь или кислоту. Бульон разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20 минут.

Питательный бульон служит основой для приготовления различных сред. Для получения плотных агаровых питательных сред к питательному бульону добавляют 2% агара, для полужидких — 0,5% агара.

Агар — это продукт морских водорослей, обладающий свойством плавится при температуре 80-85ºС и затвердевать при 40ºС. При добавлении к бульону агар превращает его в плотную среду (при комнатной температуре до 40ºС). Плотные среды, содержащие агар, называют агаровыми.

Безагаровые плотные среды — свернутая сыворотка, свернутый яичный белок сами по себе являются плотными. Свертывание белков крови, яйца проводят в свертывателе Коха при температуре 85ºС в течение 3 дней по 1 часу. В настоящее время в микробиологической практике чаще используют готовые синтетические среды в сухих порошках, которые перед использованием разводят холодной водой по инструкции, кипятят и разливают по чашкам и пробиркам.

Основные питательные среды. Простые питательные среды

К простым питательным средам относятся: мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода, питательная желатина.

Режим стерилизации питательных сред зависит от ее состава.

1. Простые питательные среды (МПА, МПБ, пептонная вода) — автоклав 1 атм. 20-30 минут.

2. Питательные среды с углеводами, молоком, желатином — автоклав 0,5 атм 15 минут или текучим паром 100ºС 1 час 3 дня.

3. Питательные среды, содержащие свернутую сыворотку и яичный белок свертыватель Коха 85ºС 1 час 3 дня.

4. Белковые среды — водяная баня 56ºС 1 час 5 дней

Перед стерилизацией посуду со средой закрывают ватно-марлевыми пробками, надевают бумажные колпачки. Количество среды не должно превышать 2/3 объема, чтобы не замочить пробки. Среды разливают в пробирки, колбы, флаконы и стерилизуют. Для контроля стерилизации среду помещают в термостат (37ºС) на двое суток. Отсутствие роста бактерий говорит о стерильности среды. Стерильные среды хранят в холодильнике за исключением сред с кровью (при комнатной температуре). Перед розливом агарной среды ее кипятят до полного растворения, после чего охлаждают до 50ºС и соблюдая правила асептики разливают в чашки Петри (при приоткрытой крышке 12-15 мл), в пробирки (столбиком - 5 мл, высоким столбиком - 10 мл, скошенным столбиком — 7 мл и укладывают пробирку под 30º, комбинированным столбиком — 7 мл и укладывают пробирку под 45º).

Занятие 2. Сложные и дифференциально-диагностические среды. Техника первичных посевов.

Знать:

1. Применение сложных питательных сред

2. Рецептуру СБ, СА, КА, Сах Б, Сах А, режимы стерилизации

3. Применение ДДС, их состав

4. Методики посева на плотные среды — шпателем, тампоном, бак.петлей, градуированными и пастеровскими пипетками.

Уметь:

1. Приготовить СБ, СА, Сах Б, Сах А, Эндо, ЭМС, Проскирева

2. Провести первичные посевы на жидкие, плотные среды

Сложные среды готовят, добавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма

1. Сах Б: к МПБ + определенное количество (0,1-2%) углевода, например глюкозы, перемешать, разлить в посуду и стерилизовать паром под давлением — 0,5 атм. 15 минут.

2. Сах А: к МПБ + 0,1-2% определенного углевода +2-3% расплавленного агара. Или к МПА + 0,1-2% определенного углевода, перемешать, разлить в посуду и стерилизовать при 0,5 атм. 15 минут.

3. Кровяной агар (КА). Готовят из стерильных простых сред, добавляя к ним в асептических условиях (работая в боксе) 3-5% крови.

Агаровые среды предварительно растапливают и остужают до 45ºС. После добавления крови, среду перемешать и разлить в стерильные чашки, оставив небольшую щель, чтобы не скапливался конденсат на внутренней поверхности крышки. Растапливать среды с кровью нельзя, т. к. она изменит свои свойства.

4. Среды с сывороткой: сывороточный бульон (СБ), сывороточный агар (СА).

Готовят из простых, стерильных сред (МПБ, МПА), добавляя в асептических условиях 10-20% инактивированной, не содержащей консервантов сыворотки. Инактивируют сыворотку при 56ºС 30 минут на водяной бане для разрушения комплемента, который губительно действует на микроорганизмы. Сыворотку осторожно вносят в простую среду, чтобы не было интенсивного пенообразования. Перемешать, разлить в стерильные чашки, пробирки.

5. ЖСА.

Дифференциально-диагностические среды

Применяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды микроорганизмов различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав ДДС входят:

1. Питательная основа, обеспечивающая размножение микроорганизмов

2. Определенный углевод — лактоза

3. Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге pH среды в кислотную сторону, вследствие ферментации соответствующего углевода.

ДДС активно применяются для дифференциации видов микроорганизмов семейства кишечных.

Элективные питательные среды

Предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологических особенностей, которые отличают микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации соли, холерного вибриона — в щелочной среде.

Разлив сред

1. Агаровых сред в чашки Петри:

а) расплавить на водяной бане, остудить до 45-50ºС с МПА

б) поставить чашку крышкой вверх

в) сосуд до средой взять в правую руку, держа его у огня

г) левой рукой вынуть пробку, зажав ее мизинцем и ладонью

д) обжечь горлышко бутылки со средой и двумя пальцами левой руки слегка приоткрыть крышку

е) ввести под нее горлышко бутыли, не касаясь им края чашки и налить 15-20 мл. среды.

Если посев проводят в день разлива среды, то её необходимо подсушить в термостате 20-30 минут в разобранном виде, открыто стороной вниз. Если посев проводят на следующий день, то чашки не подсушивая заворачивают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали и помещают в холодильник.

2. Агаровых среда в пробирки:

а) взять сосуд с расплавленной и остуженной до 45ºС средой

б) левой рукой взять пробирку

в) правой рукой извлечь пробку из пробирки, а левой рукой из сосуда со средой, зажав ее мизинцем и ладонью

г) обжечь края пробирки и сосуда со средой, внести в пробирку 3-5 мл среды

д) вновь обжечь горлышки емкостей, закрыть из пробками

Агаровые среды могут застывать в пробирках в виде:

1. Скошенного столбика

2. Комбинированного столбика

3. Столбика

Для получения скошенного и комбинированного столбика, пробирки с расплавленной агаровой массой укладывают в наклонном положении на специальную подставку, чтобы среда не заходила на 2/3 пробирки, не смачивала пробку. После застывания среды, пробирки ставят вертикально в штатив, дают стечь конденсату вниз. Пользоваться средой без конденсата нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.

Наименование	Среда Эндо	Среда Левина-ЭМС	Среда Плоскирева
Компоненты среды: 1. Питательная основа 2. Углевод 3. Индикатор	1. МПА 2. Лактоза 3. Спиртовой раствор основного фуксина, обесцвеченный раствором сульфита натрия	1. МПА 2. Лактоза 3. Водные растворы метиленовой сини и эозина	1. МПА 2. Натриевые соли жел.к-т 3. Лактоза 4. Натрий лимонно-кислый 5. Нейтральрот 6. Бриллиантовый зеленый
Принцип действия	Микроорганизмы, расщепляющие лактозу до кислоты, изменяют pH среды в кислую сторону. Связанный фуксин раствором сульфата натрия освобождается и окрашивает колонии и среду вокруг в красно-малиновый цвет. Колонии микроорганизмов, не расщепляющих лактозу, остаются бесцветными.	Микроорганизмы расщепляющие лактозу до кислоты формируют колонии темно-синего цвета,а не разлагающие лактозу образуют бесцветные колонии.	Микроорганизмы расщепляющие лактозу до кислоты формируют колонии оранжевого цвета, а не разлагающие лактозу — бесцветные.
Практическое применение	Для выделения чистых культур энтеробактерий и дифференциации лактозоотрицательных (как правило возбудителей кишечных инфекций) от лактозоположительных (например кишечные палочки)
Внешний вид среды до посева	Среда плотная, слабо розового цвета. Разливается в чашки Петри. Готовится из сухой баночной среды.	Среда плотная, темно-лилового цвета, разливается в чашки Петри. Готовится из сухой баночной среды	Среда плотная, красно-оранжевого цвета, разливается в чашки Петри. Готовится из сухой баночной среды.

Мясо-пептонный агар

Бесцветные – патогенные бактерии, окрашенные – сапрофиты.

Кровяной агар

Патогенные – образуют зоны гемолиза.

Желточно-солевой агар (ЖСА)

Сапрофиты – цветные, патогенные – бесцветные с зоной помутнения перламутрового оттенка.

Среда ЭНДО

Сапрофиты – малиновые, патогенные – бесцветные

Среда Левина ЭМС

Сапрофиты – синие, патогенные – бесцветные

Среда Плоскирева

Сапрофиты – оранжевые, патогенные – бесцветные.

Ферментативная активность МО

Знать:

1. Классы ферментов, присущие микробной клетке

2. Классификацию ферментов

3. Методики определения сахаролетическая активности

4. Определение уреазной активности

5. Определение каталазы, цитохромоксидазы, утилизации глюкозы на окислительно-ферментативной среде (ОФС).

Уметь:

1. Посев исследуемой культуры на среде Ресселя, учет результата

2. Посев исследуемой культуры на полужидкие среды Гисса, учет результатов

3. Посев исследуемой культуры на МПБ с целью определения индола по Морелю, учет результатов

4. Посев исследуемой культуры на МПБ для определения дыхательных ферментов, учет результата

5. Поставить пробу на каталазу, провести учет

6. Поставить пробу на цитохромоксидазу, провести учет

В жизнедеятельности микробов ферменты играют большую роль. Они являются обязательными участниками разнообразных биохимических реакций, лежащих в основе функций питания, дыхания, размножения. Изучение ферментативной активности микробов широко используется для определения возбудителей заболеваний, для определения из родовой и видовой принадлежности.

1. Существует 6 классов: оксидоредуктазы, гидролазы, трансферазы, лигазы, изомеразы, лиазы.

2. В зависимости от субстрата, на который они воздействуют, ферменты подразделяются на протеолитические, сахаролитические и липолитические.

3. В практической работе микробиолога имеют большое значение сахаролитические и протеолитические

4. Ферменты, синтезируемый микробами при наличии определенных новых субстратов называются адаптивными.

5. Ферменты, синтезируемые микробами постоянно, называются конститутивные.

6. Ферменты бактериальной клетки локализуются в цитоплазматической мембране (включая лизосомы), в клеточной стенке, нуклеотиде, цитоплазме.

7. Для обнаружения ферментов чистую исследуемую культуру засевают на специальные среды.

8. Для обнаружения у микробов сахаролитических ферментов чистую культуру засевают на среде ДДС: Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса, Рессель.

9. Протеолитическую активность можно определить путем постановки пробы на разжижении желатины, образование индола. H₂S, NH₃

Методики постановки биохимических тестов

Определение сахаролитической активности

Для этого используют «Пестрый» ряд Гисса, который бывает жидким и полужидким.

Жидкие среды Гисса: дистиллированная вода, пептон, поваренная соль, определенный углевод (глюкозу, лактозу, сахароза, маннит, мальтоза), индикатор (Андреде, или бромтимолблау, или ВР-водный голубой 4-розовая кислота. Разливают в пробирки по 3 мл. Для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, в каждую пробирку опускают «поплавок»-трубочку диаметром 0,5-0,7 см, запаянную с одного конца. «Поплавок» погружают в среду запаянным концом к верху. При стерилизации среды он полностью заполняются средой. Ряд Гисса содержит обычно по 5 пробирок со следующими углеводами: глюкозой, мальтозой, сахарозой, лактозой, маннитом. При расщеплении сахаров среда приобретет светлый цвет. Чем более патогенная флора, тем меньше пробирок светлого цвета.

Андреде-среды свежеприготовленные, до внесения имеют соломенно-желтый цвет; при расщеплении углевода до кислоты, цвет изменяется до ярко-розового цвета.

Индикатор бромтимол синий. Свежеприготовленные среды болотно-зеленого цвета; при расщеплении углевода среда приобретает желтый цвет. При расщеплении углевода до кислоты и газа меняется не только первоначальный цвет среды, но и происходит вытеснение жидкости, находящейся в поплавке у запаянного его конца, т. к. там собираются воздушные пузырьки.

Полужидкие среды Гисса: дистиллированная вода, пептон, поваренная соль, агар, углевод, индикатор BP. Разливают столбиком, посев исследуемой культуры уколом. Свежеприготовленные среды имеют фиолетовый цвет, при расщеплении углеводов цвет среды меняется до голубого цвета. Газообразование определяется по наличию разрыва агарового столбика.

Среда Ресселя. В состав входят: сухой питательный агар с индикатором BP, лактоза, глюкоза. Готовят на дистиллированной воде. Разливают в пробирки по 5-6 мл, стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. Затем укладывают пробирку так, чтобы при застывании получился комбинированный столбик. Первоначальный цвет среды фиолетовый (зеленый), при разложении углеводов цвет меняется на желтый. Газообразование определяется по разрыву агара. При посеве сапрофитов (кишечной палочки) вся среда изменит цвет на желтый. При посеве патогенной флоры столбик меняет цвет на желтый, скошенная часть не изменит цвет.

Все кишечные микроорганизмы расщепляют глюкозу и не расщепляют сахарозу. Лактозу расщепляют только не патогенные кишечные.

Среда Олькеницкого. Используется для определения сальмонелл. Цвет — красный, содержит глюкозу, сахарозу, лактозу, ацетат свинца, мочевина. При посеве сапрофитов вся среда изменит цвет на желтый (произойдет расщепление углеводов). При посеве патогенной флоры столбик — желтый, скос — красный (шигеллы или ирсинии); или столбик желтый, с черной полосой в верхней части, скос — красный (сальмонеллы).

Определение протеолитической активности микробов

Для определения данной активности исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок.

Посев на желатин. К МПБ добавляют мелко нарезанный желатин на 100 мл 10-15гр. Она набухает и растворяется при медленном нагревании. Добавляют 10% раствор питьевой соды до PH = 7, фильтруют. Разливают в пробирки столбиком. Стерилизуют текучим паром. При наличии желатиназы происходит расщепление белков желатины в форме: «чулка» - стафилококк, «воронки» - холерный вибрион, «перевернутой елочки» - возбудитель сибирской язвы. Наблюдение за посевом ведется до 20 суток.

Определение индола по Мореллю. Индол образуется при расщеплении триптофана. На исследуемую культуру засевают в б/м Хоттингера, где содержится триптофан. Сразу после посева под пробку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную щавелевой кислотой. Посевы инкубируют при 37С 24-48 часов. Образование индола в бульоне сопровождается окрашиванием нижнего конца индикаторной бумаги в слабо розовый цвет.

Определение индола с помощью реактива Ковача. В пробирку наливают 5 мл исследуемой культуры. Вносят 1 мл ксинола или эфира, встряхивают. После отстаивания осторожно добавляют раствор Ковача так, чтобы он образовал слой между ксинолом и средой. При положительной реакции появляется красное кольцо. Реакция высоко чувствительная.

Проба на H₂S. Исследуемую культуру засевают на питательную среду, содержащую сульфат железа. При появлении H₂S среда чернеет за счет образования сернистого железа. Образование H₂S связано с расщеплением серосодержащих аминокислот, чаще цистеина. Определить H₂S можно с помощью индикаторной бумажки, пропитанной ацетатом свинца — бумажка чернеет.

Определение ферментов, участвующих в процессе дыхания у бактерий с различным типом дыхания (окислительные формы)

Определение каталазы. Данной активностью обладают анаэробы факультативные и аэробы. Каталаза расщепляет H₂O₂ на атомарный кислород и воду. В пробирку наливают 1-2 мл испытуемой бульонной культуры, добавляют несколько капель 3% H₂O₂ в присутствии каталазы выделяются пузырьки газа.

Реакция на цитохромоксидазу. Данный фермент имеется у бактерий с аэробным типом дыхания. К культуре добавляют по несколько капель 1% спиртового раствора L-нафтола и 1% водного раствора метола. Положительная реакция проявляется в появлении лиловой окраски.

Определение пути утилизации глюкозы на ОФС. Среда позволяет дифференцировать окислительный путь утилизации глюкозы от ферментативного. Среда содержит набор солей, пептидов, индикатор бромтимол синий, агар. Культуру засевают уколом в 2 пробирки с ОФС, разлитой столбиком. В одну пробирку поверх агара наливают вазелиновое масло. Посевы термостатируют 3-4 суток. При образовании из глюкозы кислоты происходит изменение цвета индикатора (из зеленого в желтый). Образование кислоты в пробирке без масла указывает на окислительную утилизацию глюкозы. Образование кислоты в обеих пробирках говорит от преобладании бродильных процессов. Отсутствие изменения цвета среды в двух пробирках свидетельствует об отсутствии утилизации глюкозы вообще.

Бактериологический метод исследования. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (1-2 этапы)

Знать:

1. Суть бактериологического метода

2. Этапы бактериологического метода

3. Методы получения изолированных колоний

4. Методы получения чистой культуры

Уметь:

1. Провести первичный посев методом Коха и Дригальского

2. Выделить чистую культуру

План работы:

1. Бактериологический метод исследования

2. Этапы бактериологического метода

3. Понятие: чистая культура, штамм, колония

4. Методы получения изолированных колоний

5. Методы получения чистой культуры аэробных бактерий

Основным методом лабораторной диагностики инфекционных болезней является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении возбудителей из исследуемого материала и его идентификации (определения рода, вида, разновидностей).

Бактериологический метод позволяет определить:

1. Вид возбудителя и поставить диагноз заболевания

2. Антибиотики, убивающие возбудителя и назначить соответствующее лечение

3. Фаговары и серовары возбудителя для выявления источника инфекции

Этапы бактериологического метода исследования

Первый этап — первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Первичный посев проводят на накопительные среды и ДДС (чашечные среды).

Второй этап — характеристика изолированных колоний и получение из них чистой культуры путем пересева на скошенный столбик основной среды.

Третий этап — идентификация чистой культуры — определение рода, вида, разновидностей возбудителя, определение антибиотикочувствительности, определение фаговаров.

Культура микроорганизмов — это бактерии, выросшие на питательных средах. Чистая культура — это бактерии одного вида, выросшие на питательных средах. Внутри вида встречаются разновидности, отличающиеся по одному признаку:

1. Морфовары — отличаются по морфологии

2. Хемовары — отличаются по биохимическим свойствам

3. Серовары — отличаются по антигенным свойствам

4. Фаговары — отличаются по чувствительности к фагам

Чистая культура необходима для проведения идентификации, определения сероваров, фаговаров, чувствительности к антибиотикам. Штамм — это бактерии одного вида, выделенные из конкретного источника (река Волга, больной Иванов и т. д.). Колония — видимое скопление бактерий одного вида, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде.

Первый этап исследования — первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Перед первичным посевом проводят микроскопию исследуемого материала. Исследуемый материал как правило содержит смесь различных бактерий, в том числе и возбудителей болезни. Для выделения возбудителя необходимо получить изолированные колонии (бактерии одного вида) путем подбора питательной среды и специальными методами посева.

Существует два метода получения изолированных колоний:

1. Метод Дригальского

2. Метод Коха

Метод Дригальского

Готовят три чашки Петри с стерильной питательной средой. В первую чашку наносят пипеткой одну каплю материала. Распределяют по поверхности стерильным шпателем (посев газоном). Этим же шпателем (не обжигая его и не внося материала) проводят посев газоном на вторую чашку, а затем третью чашку.

Варианты метода Дригальского:

1. Каплю материала помещают на край чашки со средой, растирают шпателем на небольшом участке, а затем растирают шпателем всю поверхность не касаясь участка с материалом.

2. Посев исследуемого материала бакпетлей на сектора чашки Петри.

Метод Коха

Готовятся резведения исследуемого материала. В каждую пробирку с разведениями наливают расплавленный и охлажденный до 45ºС питагар. Перемешивают и содержимое пробирок выливают в чашки Петри для застывания. Чашки Петри с засеянным материалом ставятся вверх дном в термостат на 37ºС на 18-20 часов для выращивания (культивирования) бактерий.

Условия культивирования аэробов

Культивирование аэробных бактерий проводят на жидких и плотных питательных средах при постоянной температуре (в термостате).

1. Температура. Оптимальная температура для большинства патогенных бактерий 37ºС.

2. Сроки культивирования. Для большинства патогенных бактерий 18-20 часов при росте на плотных средах и 6-8 часов — на жидких средах. Микобактерии туберкулеза культивируются до 6 недель.

3. Свет. Патогенные бактерии равнодушны к свету. Растут в темноте. Для выявления пигментов необходим свет.

4. Влажность. Необходимо использовать свежеприготовленные среды. Для влаголюбивых культур (коклюш, менингококк) в термостат ставят сосуд с водой.

5. Аэрация — достаточно пассивной аэрации — кислорода поступающего через ватно-марлевые пробки и зазора между крышкой и дном чашки Петри.

Второй этап исследования — изучение изолированных колоний (культуральные свойства) и получение чистой культуры. После термостатирования изучают культуральные свойства колоний, микроскопируют (готовят мазок из части колонии и окрасить по Граму) и подозрительные колонии бакпетлей штрихом пересевают на скошенный агар для накопления чистой культуры.

Засеянные пробирки помещают в термостат 37ºС на 18-20 часов. После получения чистой культуры приступают к третьему этапу исследования.

Техника посева различного биологического материала и выделения чистых культур

Главной целью лабораторной бактериологической диагностики является выделение и идентификация микроба-возбудителя инфекционного заболевания.

Первым этапом исследований — работа с поступившим от больных инфицированным материалом.

Рабочий стол лаборанта-бактериолога. Он должен соответствовать противоэпидемическим и санитарно-гигиеническим требованиям: поверхность стола покрыта гигиеническим пластиком или линолеумом, что дает возможность легко дезинфицировать ее; освещение поверхности стола должно быть равномерно-рассеянным, следует избегать прямых солнечных лучей.

На столе размещают: склянку с дезинфицирующим раствором, лотки, штативы, спиртовку или газовую горелку, ватные тампоны или марлевые салфетки, пинцеты и бактериальные петли, стерильные пипетки и шпатели Дригальского, стерильные жидкие и плотные питательные среды, пробирки с исследуемым материалом.

Различные варианты материала для исследования, взятые разными способами:

1. Тампон со слизью из зева, такой материал забирают при ангинах, коклюше, дифтерии и других воздушно-капельных инфекциях.

2. Пробирка со взвесью кала в консерванте и ректальной петлей — материал при кишечных инфекциях.

3. Материал жидкой консистенции — моча, ликвор, экссудаты.

4. Кровь — важный материал для диагностики, так как она нормально стерильна и содержит микробы только при инфицировании человека или животного.

5. Тампоны со смывами, которые позволяют контролировать санитарно-эпидемиологическое состояние объектов внешней среды.

Все штативы с материалом стоят в лотках, во избежание разбрызгивания, если разобьется или опрокинется пробирка.

Работа с кровью и ее составными частями требует соблюдения особых правил безопасности. Работать нужно обязательно в резиновых перчатках.

Техника первичного посева

Чтобы выделить микробов-возбудителей инфекционных заболеваний из исследуемого материала, необходимо засеять его на питательные среды. В зависимости от свойств и консистенции доставленного материала посев проводят различными способами.

Посев в жидкие питательные среды

В пробирку бактериальной петлей. При посеве в жидкую среду в пробирке, например гноя, посевной материал, взятый бактериальной петлей с соблюдение асептики (открываем пробку пробирки и фламбируем ее горлышко и пробку, а затем вносим на бактериальной петле материал), растирают по стенке пробирки над средой, а затем, при легком наклоне пробирки, смывают материал в питательную среду.

В пробирку тампоном. При посеве материала с тампонов в жидкую питательную среду тампон погружают с соблюдением правил асептики в среду и 3-5 секунд выдерживают в ней. Далее оставляют тампон в среде (если в материале мало микробных клеток) или извлекают тампон из пробирки, отжав его о стенки пробирки.

При наклоне пробирки нужно следить, чтобы среда не смочила пробку. Отработанный тампон помещаем в склянку с дезраствором.

На среды накопления. Стерильную жидкую питательную среду (в определенном объеме, чаще 5 мл) с соблюдением стерильности забирают пипеткой из колбы или флакона, а затем вносят в пипетку со средой в пробирку. После окончания посева фламбируют, пробирку закрывают пробкой и ставят в штатив.

Во флаконы. Этот способ обычно применяют при засеве крови: во флакон со стерильной питательной средой с соблюдением правил асептики вносят кровь в соотношении 1:10.

Посев на плотные питательные среды

Шпателем Дригальского. Шпатель Дригальского — это стеклянная или металлическая палочка, конец которой загнут в виде треугольника. Для посевов пользуются стерильным шпателем.

Чашку Петри со стерильной плотной питательной средой ставим слева, а справа — штатив с бактериальной петлей и пробиркой с посевным материалом, левой рукой приоткрываем крышку чашки Петри , держа ее большим и указательным пальцем. Бактериальной петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность среды ближе к центру чашки каплю материала, затем тщательно втирают его в питательную среду круговыми движениями шпателя, добиваясь его скольжения. Левой рукой придерживают крышку и одновременно вращают чашку. По окончанию посева шпатель помещают в дезинфицирующий раствор.

Тампоном. Если нет специальных указаний, то тампон с посевным материалом вносят в приоткрытую чашку Петри с питательной средой и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, вращая при этом тампон и чашку. Для выделения некоторых возбудителей применяют специальные способы посевов: на дифтерию — втирание круговыми движениями, на коклюш — площадками (площадки сброса — 4 и посев в центре чашки), на менингококк — посев штрихами с отрывом.

Бактериальной петлей. На петлю берут небольшое количество посевного материала и вносят его в чашку Петри со средой, слегка приподнимая ее крышку; втирают материал петлей у края среды, несколько раз проводя петлей из стороны в сторону. Затем чистый агар прокалывают петлей для снятия излишка материала и оставшийся на петле материал зигзагообразными движениями распределяют по оставшейся поверхности среды.

Выращивание культур

После завершения посева необходимо подписать пробирки соответствующими номерами и поставить в один штатив. Все штативы и чашки с посевами ставят на лоток и только в нем переносят к термостату. Инкубация посевов в термостате при 37°С обычно занимает 18-20 часов. Чашки Петри с посевами помечают со стороны дна и кверху дном ставят на полку термостата, чтобы образовавшиеся капли конденсата с крышки не попали на посев.

В процессе термостатирования на средах вырастает микробная культура. Для дальнейшего изучения ее и выделения чистой культуры, то есть микробов одного вида, применяют различные методы пересева.

Техника пересева микробной культуры

В пробирки, штрихом на скошенный агар. С чашки Петри с культурой, бактериальной петлей, с соблюдением правил асептики, легким скользящим движением, не травмируя поверхность агара, снимают часть изолированной колонии. Затем вносят бак.петлю с культурой в пробирку со скошенным агаром до границы конденсата и проводят зигзагообразные движения снизу вверх по поверхности агара.

Нельзя касаться стенок пробирки бактериальной петлей и погружать ее в агар. Бак.петля должна скользить по поверхности среды. На всех этапах пересева необходимо соблюдать правила асептики.

В пробирки, уколом в столбик агара. Бактериальной петлей с микробной культурой прокалывают столбик агара и резким движением вынимают петлю по уколу.

В пробирки, в комбинированный столбик. Для изучения ферментативной активности микробов проводят комбинированный посев в среду, разлитую высоким столбиком со скошенной частью. Культуру засевают зигзагообразными движениями по скошенной части от конденсата, а затем — уколом в центр столбика.

В пробирку с жидкой средой пересев проводят так же, как первичный посев.

Из пробирки в пробирку. При обучении этот пересев выполняют в два этапа: сначала забирают культуру из пробирки, а затем пересевают ее на питательную среду в другой пробирке, соблюдая правила асептики. Более опытные лаборанты сеют одновременно, держа в левой руке две пробирки вместе.

При пересевах на скошенный агар в пробирках, их располагают посевной поверхностью кверху.

В чашки Петри на секторы. Чашку Петри со стерильной плотной питательной средой со стороны дна расчерчивают на секторы. Пересев культуры производят зигзагообразными движениями от края сектора к центру. При этом нужно следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.

Посев газоном (капельным методом). Для пересева культура должна находится в жидкой среде. В стерильную пустую чашку Петри вносим пипеткой определенный объем, обычно 1 мл микробной культуры. Заливаем чашку остуженным до 45°С МПА (10-12 мл) и перемешиваем легким покачиванием и вращением чашки. Оставляем чашку на столе до застывания среды. Можно предварительно расплавленную и остуженную до 45°С агаризованную среду внести в пробирку с культурой, а затем взвесь быстро вылить на дно чашки Петри и оставить до застывания.

Посев газоном. Культуру в жидкой среде объемом 1 мл наносят пипеткой на поверхность агаризованной среды в чашке Петри и равномерно распределяют легким покачиванием чашки, далее чашку наклоняют и пипеткой удаляют избыток культуры. Пипетку с культурой помещают в склянку с дезинфицирующим раствором.

Посев по методу Шукевича. Определяют присутствие в материале протея. Берут 0,1 мл взвеси материала и не касаясь поверхности агара (т. е. повернув скошенную часть вверх) засевают в конденсационную воду. При наличии протея после термостатирования на поверхности скошенного агара появляется ползучий, вуалеобразный рост микробов.

Бактериологический метод исследования — 3 этап. Идентификация чистой культуры бактерий

Знать:

1. Задачи идентификации

2. Алгоритм идентификации

3. Оценка морфологических свойств

4. Оценка культуральных свойств

5. Оценка биохимических свойств

6. Определение чувствительности к антибиотикам и фагам

Уметь:

1. Провести учет морфологических свойств

2. Провести учет культуральных свойств

3. Провести учет биохимических свойст

4. Определить чувствительность к антибиотикам

5. Провести фаготипирование

6. Оформить протокол исследования

7. Выдать заключение

План работы:

1. Задачи идентификации

2. Алгоритм идентификации

3. Определение вида бактерии по его свойствам

4. Оформление протокола исследования

5. Определение чувствительности к антибиотикам

6. Фаготипирование

7. Выдача заключения

Идентификацию бактерий (определение рода, вида, биовара) для постановки диагноза болезни, определение чувствительности к антибиотикам для назначения лечения и фаготипирование для выявления источника инфекции проводят только с чистой культурой.

Третий этап исследования — идентификация чистой культуры начинается с просмотра роста на скошенном агаре и проверке чистоты культуры. Для проверки чистоты культуры делают мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Однородность микроскопической картины подтверждает чистоту культуры (морфологические и тинкториальные свойства).

Со скошенного агара бак.петлей делют пересевы чистой культуры на:

1. Ряды Гисса уколом в столбик (сахаролитические свойства чистой культуры)

2. Бульон с индикаторными бумажками (протеолитические свойства чистой культуры)

3. Полужидкий агар уколом в столбик (определение подвижности по Пешкову)

4. Основные питательные среды (плотные и жидкие) — культуральные свойства.

5. При необходимости ставят дополнительные тесты

6. Антигенные свойства изучают с помощью серологических реакций.

Все посевы помещают в термостат 37°С на 18-20 часов. На следующий день (через 18-20 часов) проводят учет результатов. Результаты заносят в протокол.

Протокол идентификации чистой культуры:

Морф. св-ва

Окраска по Граму

Характеристика роста

Биохимические свойства

Подвижность по Пешкову

ПА

ПБ

Ферментация

Образование

Гл

Лак

Сах

Мал

Ман

HS

ИНД

NH

Учет морфологических и тинкториальных свойств

Отмечают форму и размер бактериальных клеток, взаиморасположение, наличие спор, капсул, подвижность, отношение к окраске по Граму. Например: кокки D 1мкм, гроздьями, спор и капсул не имеют, неподвижны, Гр+.

Учет культуральных свойств

Отмечают:

1. Характеристику колоний

2. Характер роста на скошенном агаре

3. Характер роста на жидких питательных средах

4. Характер роста на полужидком агаре

Характеристика колоний

1. Размер (крупные Д — 4-5 мм, средние Д 3-4 мм, мелкие Д 1-2 мм)

2. Форма (круглые, розеткообразные, листовидные)

3. Цвет (бесцветные, белые, желтые, зеленые, черные и др.)

4. Поверхность (выпуклая, плоская, вдавленная, гладкая, морщинистая, блестящая, мутная).

5. Края (ровные, изрезанные)

6. Консистенция (влажная, сухая, слизистая)

Например: колонии крупные, круглые с ровными краями, желтого цвета, выпуклые, блестящие, влажные).

Характер роста на скошенном агаре

Сухой, влажный, ползучий, складчатый, пигментированный.

Характер роста на жидких питательных средах

1. Помутнение питательной среды

2. Образование осадка (пылевидный, хлопьевидный, зернистый)

3. Образование пленки (нежная, грубая, морщинистая)

Например: помутнение питательного бульона.

Характер роста на полужидком агаре

Определяют подвижность бактерий по Пешкову. При посеве уколом в столбик с полужидким агаром подвижные бактерии вызывают помутнение всего столбика, а неподвижные — помутнение по месту укола, а остальная среда прозрачна.

Например: отмечено помутнение по месту укола.

Учет биохимической активности

Сахаролитическую активность отмечают по изменению окраски и наличия пузырьков газа в пробирках ряда Гисса (пестрый ряд). Неизменность окраски говорит об отсутствии у бактерий ферментов расщепляющих сахара. В протоколе ставят «-». Изменение окраски и появление пузырьков газа говорит о ферментации сахара до кислоты и газа (КГ). Изменение окраски и отсутствие пузырьков газа говорит о ферментации сахара до кислоты (К).

Помимо рядов Гисса сахаролитическую активность определяют на ДДС — лактозосодержащие среды (Эндо, Левина, Плоскирева) и дисахаридной среде Ресселя (глюкоза, лактоза).

Протеолитическую активность отмечают:

1. По расщеплению белков до образования индола, сероводорода, аммиака (изменение цвета индикаторных бумажек (почернение — HS, покраснение — ИНД, посинение — аммиак).

2. По характеру разжижения желатина

3. По способности свертывать молоко

Например: выделенная культура ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, манит до кислоты. Образует сероводород и индол. Разжижает желатин в виде чулка. Свертывает молоко.

Определение типа дыхания

Аэробы — цитохромоксидаза + каталаза +

Факультативные анаэробы — цитохромоксидаза — каталаза +

Облигатные анаэробы — цитохромоксидаза — каталаза —

Для идентификации имеет значение изучение гемолитической активности (на кровяном агаре), наличия плазмокоагулазы и другие тесты. На основании изучения всех признаков дается заключение: род, вид, биовар, серовар возбудителя по латыни.

Например: выделенная бактерия Гр+, кокки, располагаются гроздьями, неподвижны, спор и капсул не образует. Колонии крупные с ровными краями, выпуклые, блестящие, желтого цвета, вызывают помутнение бульона. Расщепляет глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, манит до кислоты. Образует сероводород и индол. Разжижает желатин в виде чулка. Свертывает молоко. Окончательный ответ: Stapylococcus aureus.

После идентификации определяют чувствительность выделенной бактерии к антибиотикам методом бумажных дисков — для назначения лечения. Проводят фаготипирование выделенной бактерии с помощью набора фагов.

Схема бактериологического исследования

Методы выделения анаэробных бактерий

Знать:

1. Забор исследуемого материала для выделения анаэробов

2. Условия культивирования анаэробов

3. Методы культивирования анаэробов

4. Питательные среды для анаэробов

Уметь:

1. Провести первичный посев исследуемого материала:

• на среду Китта-Тароцци

• на среду Вильсона-Блера

• методом Виняла-Вийона

• методом Штурм

План работы:

1. Особенности культивирования анаэробов

2. Метода культивирования анаэробов

3. Питательные среды

4. Методы выделения анаэробов

В зависимости от типа дыхания бактерии делятся на аэробные (облигатные аэробы — окислительный тип дыхания (кислородом) и факультативные анаэробы — окислительный тип дыхания и ферментативный тип дыхания (без кислорода), а также облигатные анаэробы — ферментативный тип дыхания (без кислорода).

К возбудителям анаэробных инфекций относятся:

1. Гр+ спорообразующие анаэробные палочки — клостридии столбняка, газовой гангрены, ботулизма.

2. Неспорообразующие анаэробные кокки — вейллонеллы, бактероиды, пептококки, пептострептококки — обитатели кишечника человека.

Для обеспечения бескислородных условий взятие материала производят шприцом с притертым поршнем до полного его заполнения и вытеснения воздуха. Затем шприц надевают на иглу, вставленную через резиновую пробку в пробирке со смесью инертных газов (кислорода нет) и вводят в нее исследуемый материал, который доставляют в лабораторию.

Особенностью культивирования анаэробов является их выращивание на бескислородных питательных средах и в бескислородной атмосфере. Для удаления кислорода из питательных сред используют физические, химические и биологические методы.

Физические методы удаления кислорода основаны на механическом удалении кислорода.

1. Использование анаэростатов (прибор, создающий вакуум) для выращивания анаэробов — туда помещают чашки с посевами, создают бескислородные условия, а затем анаэростат помещают в термостат. При отсутствии анаэростата чашки помещают в экикатор, ставят на дно зажженную свечу для поглощения кислорода, закрывают эксикатор герметичной крышкой и ставят в термостат.

2. Культивирование анаэробов в высоком столбике агара — на дне пробирки создаются бескислородные условия. Посев делают уколом. После посева пробирку быстро охлаждают под струей холодной воды для предотвращения поглощения средой кислорода.

3. Культивирование анаэробов в жидкой среде Китта-Тароцци. Перед посевом жидкую среду регенерируют (удаляют кислород путем ее кипячения на водяной бане 20 минут). После посева среду резко охлаждают под струей холодной воды (для предотвращения поглощения кислорода). Поверхность среды заливают вазелиновым маслом для защиты от кислорода воздуха и закрывают резиновой пробкой.

4. Метод Виньяла-Вийона — исследуемый материал, помещенный в пробирку, заливают расплавленным агаром, а затем засасывают смесь во весь объем пастеровской пипетки. Запаивают пипетку с обеих концов и помещают в термостат. Колонии, выросшие в толще агага, извлекают после распиливания пастеровской пипетки.

5. Метод Штурм — исследуемый материал вносят в крышку чашки Петри и заливают расплавленным горячим агаром на ¼ объема и закрывают дном чашки, так, чтобы агар залеплял зазор между крышкой и дном.

Химические методы удаления кислорода основаны на использовании химических веществ для удаления кислорода. Для этого в состав питательных сред вводят редуцирующие вещества, т. е. вещества, поглощающие кислород из среды. К ним относят глюкозу, кровь, тиогликолевую кислоту, кусочки печени.

Биологические методы удаления кислорода. Метод Фортнера — в чашку Петри, разделенную желобком на две части засевают аэробную и анаэробную культуры. Сначала растут аэробы, поглощая при этом кислород, а затем в бескислородных условиях начинают расти анаэробы.

Питательные среды для выращивания анаэробов

Пробирочные среды закрываются резиновыми пробками.

Среда Китта-Тароцци (жидкая, коричневая) — среда накопления и выделения чистой культуры. Состав: питательный бульон с 3 кусочками сырой бычьей печени. В пробирку наливают 8 мл бульона, добавляют кусочки печени, заливают вазелиновым маслом, закрывают резиновой пробкой и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин. Перед посевом среду регенерируют кипячением 20 минут. После посева пробирку охлаждают. Рост анаэробов характеризуется помутнением среды.

Среда Вильсона-Блера (плотная, готовая, желтая, высокий столбик) — для первичного посева. Состав: питательный бульон, 1% глюкозы, сульфит натрия и хлорное железо. Расплавленной и горячей (70ºC) средой Вильсона-Блера заливают внесенный в пробирку материал высоким столбиком. Пересевы делают уколом в высокий столбик. После посева среду охлаждают под холодной водой. Колонии — черные, образуются внутри агара в виде чечевицы.

Чашечные среды

Сахарный агар. Состав: питательный агар + 1% глюкозы (цвет — желтый).

Кровяной агар с глюкозой (агар Цейсслера, цвет — красный).

Тиогликолевая среда (цвет — желтый) (аналог Китта-Тароцци, чаще всего жидкая).

ГЭСПЭК упакованные готовые пробирочные среды лишенные кислорода.

Посевы на чашки осуществляются методом Фортнера, Штурм и др. После посева зазор между крышкой и дном чашки заливают парафином, либо обматывают изоляционной лентой. Все посевы помещают в анаэростат и ставят его в термостат.

Выделение анаэробов

1 этап. Первичный посев исследуемого материала — в пробирки с жидкой средой Китта-Тароцци (материал вводится шприцом) и со средой Вильсон-Блера (исследуемый материал заливается горячей средой высоким столбиком). Помещают в анаэростат. После термостатирования при 37ºC в течение 48 часов для получения изолированных колоний делают пересевы на плотные питательные среды (Вильсона-Блера — уколом в высокий столбик, на чашки с агаром Цейсслера). Посевы помещают в анаэростат и термостатируют при 37ºC 24-48 часов.

2 этап. Чистую культуру получают на среде Китта-Тароцци путем пересева в нее части колонии с плотны сред.

3 этап. Идентификацию анаэробов проводят с чистой культурой, выросшей на среде Китта-Тароцци.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом бумажных дисков

План занятия:

1. Характеристика микробных культур, испытуемых на чувствительность к антибиотикам.

2. Характеристика питательных сред, применяемых для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам диск-диффузионным методом.

3. Методика постановки диск-диффузионного опыта.

За время занятия студент должен знать:

1. Классификацию антибиотиков

2. Активность антибиотиков, бактериальный спектр действия

3. Подготовку испытуемой культуры к опыту

4. Приготовление питательной среды

5. Методику постановки определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам диск-диффузионным методом

6. Учет опыта

За время занятия студент должен уметь выполнить

1. Приготовить смыв исследуемой культуры, отстандартизировать его по оптическому стандарту мутности.

2. Приготовить питательную среду Мюллера-Хинтона и АГВ

3. Выполнить посев культуры «широким газоном»

4. Уложить диски с антибиотиками с помощью картриджей или пинцетом

5. Провести учет опыта

Содержание материала: