65. Концепция теоретических тарелок. Пик

Модель "теория тарелок" была создана для объяснения процесса разделения веществ в хроматографической колонке (в которой происходит разделение исходной многокомпонентной смеси на ряд бинарных смесей). Теоретическая тарелка – условный участок хроматографической колонки, в пределах которого устанавливается равновесие частиц между подвижной и неподвижной фазами

Выражение «теоретические тарелки» пришло в хроматографию из терминологии ректификации. Технические ректификационные колонны часто содержат ряд реальных тарелок, которые действительно можно сосчитать или которые заполнены «насадкой», чья эффективность может быть выражена через число теоретических тарелок. Колонки наполнены частицами и, разумеется, не содержат тарелок, но и в этом случае можно рассчитать число теоретических тарелок. Чем выше это число, тем больше эффективность колонки и вместе с тем, потенциал разделения различных компонентов. Хотя эту величину называют эффективностью колонки, число теоретических тарелок описывает эффективность целой хроматографической системы, включая систему ввода пробы, детектор и, возможно, соединительные элементы.

Эффективность хроматографической систем- Эффективность в численном выражении определяется значениями числа теоретических тарелок и высотой, эквивалентной теоретической тарелке.

Число теоретических тарелок, N - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая по параметрам удерживания выбранного вещества по формуле

N = 16(tR/Wb)2 = 5.545(tR/Wh)2,

где tR - время удерживания пика, Wb - ширина пика на его полувысоте, Wh - ширина пика у основания.

Хроматографический пик - участок хроматотраммы, соответствующий площади ограниченной функцией хроматограммы в момент выхода определяемого вещества из колонки и базовой линией.

Основание пика - продолжение нулевой линии, соединяющее начало и конец хроматографического пика.

Площадь пика, S - площадь хроматограммы, заключенная между пиком и его основанием. В первом приближении

S = hWh

Высота пика, h - расстояние от максимума пика до его основания, измеренное вдоль оси отклика детектора.

Ширина пика у основания, Wb - отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика.

66. Ионообменная (колоночная) хроматография

Метод ионообменной хроматографии основан на обмене ионов между анализируемым веществом, находящемся в рас­творе, и сорбентом.

Сорбенты содержат ионогенные группы, способные к диссо­циации и обмену ионами с анализируемым раствором. Такие сорбенты называют ионитами или ионообменниками.

Ионообменная хроматография, являющаяся разновидностью жидкостной хроматографии, основана на эквивалентном обмене ионов раствора на ионы твердой фазы. В отличие от абсорбции ионный обмен описывается стехиометрическим химическим уравнением, что важно и для ионной хроматографии. Однако в ионообменниках часто наблюдается и физическая адсорбция.

Разделение в этом случае происходит благодаря разному сродству компонентов определяемой смеси к неподвижной фазе и, следовательно, разным скоростям перемещения по колонке.

Неподвижной фазой в ионообменной хроматографии являются ионообменники: катиониты (слабо- и сильнокислотные) и аниониты (слабо- и сильноосновные).

Основные хроматографические разделения с применением ионообменников проводят в водных растворах, смешанных растворителях (вода — метанол) или в водных буферных растворах.

Ионообменная хроматография широко используется для решения многих биохимических проблем в научных исследованиях.

Для практических целей ионообменную хроматографию наиболее широко используют для анализа аминокислот. Особенно широкую популярность ионообменная хроматография аминокислот получила с появлением аминокислотных анализаторов, позволяющих автоматизировать почти все стадии анализа за исключением подготовки пробы.

Автоматический аминокислотный анализатор позволяет проводить анализ смеси аминокислот белковых гидролизатов.

Механизм анионного обмена можно представить в виде уравнения:

X ^- + R⁺Y ^- ↔ Y ^- + R⁺X ^-

Аналогично уравнение для катионного обмена:

Х⁺ + R ^-Y⁺ ↔ Y⁺ + R ^-X⁺

В первом случае ион образца X ^- конкурирует с ионом подвижной фазы Y ^- за ионные центры R⁺ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y⁺за ионные центры R ^- вступают катионы образца Х⁺.

Чаще всего в ионообменной хроматографии применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный и боратный. Селективность разделения в ионообменной хроматографии зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от рН среды. Ионообменное разделение можно проводить при повышенных температурах (40-60°С). Чем выше температура, тем меньше вязкость подвижной фазы. С другой стороны, более высокие температуры снижают стабильность колонки. Биохимические пробы для сохранения нативных структур и биологической активности принято разделять при низких температурах (4 - 20°С).