17. Накопительные и чистые культуры микроорганизмов, методы их получения, значение; культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов, поверхностное и глубинное культивирование.

Поскольку микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному кислороду, это определяет и различия в способах их культивирования. Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим образом: • на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха; • в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование. Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для создания анаэробных условий используют различные приемы. Их подразделяют нафизические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве. К физическим методам создания анаэробных условий относится культивирование в микроанаэростате – вакуумном аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с

5 % СО2 и 10 % Н2. К химическим методам относится: 1) Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. 2) Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, аскорбиновая кислота. Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре: • выращивание в высоком слое среды; • выращивание в толще плотной среды; • культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее плотности; • заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.

18. Методы количественного учета микроорганизмов и методы хранения чистых культур микроорганизмов.

О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по величине титра клеток. Титр клеток (или фаговых частиц) – это количество клеток в единице объема.

Методы прямого подсчета клеток под микроскопом используют для определения общего количества микроорганизмов в различных материалах. Это такие методы как подсчет в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, на мембранных фильтрах. Преимущества использования методов прямого подсчета клеток: - широко применяются в исследованиях микрофлоры воды и почвы;- эффективность такого подсчета, как правило, в 10 – 10000 раз выше, чем при подсчете методом высева;- позволяет определить общее количество клеток в единице объема;- дает возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта;- производится быстрее, более дешев, оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом. Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит измерение количества света, рассеянного взвесью клеток. Величину светорассеяния измеряют с помощью нефелометров, спектрофотометров или фотоэлектроколориметров. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, падает на фотоэлемент.Определение количества жизнеспособных клеток путем высева на питательные среды (чашечный метод Коха). Сущность метода подсчета количества клеток путем высева заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая колония – потомство одной жизнеспособной клетки. Существует много вариантов метода: •При посеве на поверхность агара (метод Коха). Проводят в три этапа: приготовление разведений исследуемого материала, посев на агаризованную среду в чашках Петри и подсчет сформировавшихся колоний. •Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 450 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть. •Метод посева в тонком слое агаризованной среды предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 –3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою. Методы хранения культур микроорганизмов: 1) периодическими пересевами (субкультивирование); 2) под минеральным маслом; 3) высушиванием; 4) лиофилизацией; 5) в условиях низких и ультранизких температур. Субкультивирование – традиционный метод хранения культур и заключается он в пересевах культур на свежие питательные среды один-два раза в месяц. Хранение под минеральным маслом заключается в следующем: культуру микроорганизмов выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде и заливают стерильным вазелиновым маслом. Слой масла (0,5 – 1,0 см) замедляет скорость обменных процессов микроорганизмов и предохраняет поверхность среды от высыхания. Высушивание – простейший метод хранения микроорганизмов, в процессе которого происходит обезвоживание микробных клеток. В высушенных клетках биохимические реакции приостанавливаются или протекают очень медленно. Лиофилизация заключается в удалении воды из замороженных суспензий под вакуумом, т. е. при этом вода испаряется, минуя жидкую фазу. Хранение микроорганизмов при низких и ультранизких температурах используется в тех случаях, когда культуры не выдерживают лиофилизации. Микроорганизмы замораживают либо в рефрижераторах (от – 12 °С до – 80 °С) либо используют рефрижераторы с азотом: газово-фазовый (– 150 °С) или жидко-фазовый (– 196 °С).

19. Рост клетки и популяции микроорганизмов: сбалансированный и несбалансированный рост; закономерности роста чистых культур при периодическом культивировании: кривая роста, характеристика отдельных фаз.

Рост – это согласованное увеличение количества всех химических компонентов, формирующих клеточные структуры. Рост клеток обычно сопровождается увеличением их массы и размеров. В подходящей среде, к которой бактерии полностью адаптированы, они находятся в состоянии сбалансированного роста. В период сбалансированного роста удвоение биомассы сопровождается удвоением всех других учитываемых параметров популяции, например, количества белка, ДНК, РНК и внутриклеточной воды. Иными словами, культуры, растущие сбалансированно, сохраняют постоянный химический состав. Скорость роста может снижаться по следующим причинам: из-за недостатка субстрата, вследствие высокой плотности бактериальной популяции, при низком парциальном давлении кислорода или по причине накопления токсичных продуктов обмена. Все эти факторы обусловливают переход к стационарной фазе. Переход в стационарную фазу включает период несбалансированного роста, когда компоненты клеток синтезируются с различными скоростями. Соответственно, и содержание отдельных химических веществ в клетках на разных стадиях отличается.В лабораторных и промышленных условиях используют два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое и непрерывное. Периодическая культура - это популяция клеток в ограниченном жизненном пространстве. Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Зависимость концентрации жизнеспособных клеток при периодическом культивировании от длительности инкубирования описывается характерной кривой, которая имеет S-образную форму. На кривой можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: лаг-фазу; логарифмическую фазу; стационарную фазу; фазу отмирания. Лаг-фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией бактерий и достижением ими максимальной скорости деления. В клетках бактерий в этот период идут в основном процессы, связанные с приспособлением их к условиям культивирования. Происходит быстрое увеличение количества РНК (в 8–12 раз). Во время лаг-фазы деления клеток не происходит, отмечаются лишь процессы, которые подготавливают клетку к размножению. Лаг-фаза переходит в начальную фазу размножения, когда клетки начинают делиться с постепенно возрастающей скоростью. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и скоростью роста. Для различных видов бактерий эти величины могут варьировать в значительных пределах. Стационарная фаза наступает тогда, когда число жизнеспособных клеток достигает максимума и не увеличивается, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. В связи с тем, что скорость роста определяется концентрацией субстрата, то еще до его полного использования начинает снижаться и скорость роста, поэтому переход от логарифмической фазы к стационарной происходит постепенно. В стационарной фазе роста поведение клеток в бактериальной популяции может регулировать явление, которое получило название апоптоз. Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция бактерий разделяется на две субпопуляции, одна из которых погибает и подвергается автолизу, клетки же другой популяции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться. В фазе отмирания происходит логарифмическое снижение числа живых клеток. Скорость отмирания бактерий существенно варьирует в зависимости от условий среды и физиологических особенностей организма. Причины отмирания клеток могут быть разными: накопление органических кислот, автолиз, накопление антибиотиков, бактериоцинов и др.