Микроскопические исследования

Микроскопия - обязательный метод всякого бактериального исследования.

С помощью световой микроскопии выявляют микробов в первичных материалах, в посевах и органах зараженных лабораторных животных, определяют форму и величину бактериальных клеток, свойственное им расположение (соединение), подвижность, способность воспринимать окраску, образовывать капсулы, споры, жгутики, формировать включения и зернистость. Иногда эти признаки весьма характерны и имеют важное значение при идентификации бактерий. В других случаях можно лишь констатировать. что наблюдаемые морфологические и тинк­ториа.1ьные свойства микроба соответствуют виду, определенному с помощью других методов. Но такое подтверждение тоже необходимо.

Значительно большее значение при идентификации патогенных микробов имеет люминесцентно-серологический метод, позволяющий наблюдать одновре­менно форму микроба и его реакцию с антителами.

Исследование живых микробов. Его проводят главным образом для опре­деления подвижности бактерий. Препараты лучше готовить из молодых культур через 3-6 ч после высева в жидкую питательную среду: в эти сроки подвиж­ность, свойственная тем или иным видам микробов, наиболее выражена. Если среда мутная, то пробу берут из верхнего слоя культуральной жидкости; прозрачную среду при наличии осадка предварительно встряхивают.

Метод – «раздавленная капля». Небольшую каплю культуры помещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом так, чтобы не образова­лись пузырьки воздуха; излишек жидкости, выступившей из-под стекла, убирают фильтровальной бумагой. Препарат исследуют под микроскопом сразу же после приготовления. Во избежание быстрого высыхания препарата нижние края покровного стекла перед накрыванием капли тонко смазывают вазелином.

Метод – «висячая капля». Берут предметное стекло с лункой и смазывают ее края тонким слоем вазелина. На чистое профламбированное и остывшее по­кровное стекло, в центр, помещают маленькую каплю культуральной жидкости. Предметным стеклом лункой книзу накрывают каплю так, чтобы она оказалась под центром лунки. При небольшом нажиме стекла склеиваются, после чего препарат переворачивают покрывным стеклом вверх. Висячая капля не должна касаться дна и краев лунки.

Исследование окрашенных микробов. Микроскопия окрашенных микробов - основной способ изучения их формы и строения. Окрашенные бактерии хорошо заметны в поле зрения. Многочисленные способы окраски позволяют наблюдать все детали клетки: капсулу, жгутики, эндогенные образования и включения.

Процесс окрашивания препаратов обычно включает следующее этапы: выбор кpaсок и приготовление их рабочих растворов; приготовление мазков, их высушивание и фиксирование; окраску препаратов по избранному способу и их промывание.

Приготовление красок. Красители для микробов имеют, кислую щелочную или нейтральную реакцию. Многие виды бактерий хорошо красятся основными красками, но вообще способность микробов воспринимать кислые или основные краски зависит от возраста культуры и реакции среды (мазка). Учитывая это, В растворы красителей вводят щелочи или кислоты.

Обычно применяют водные и спирто-водные растворы красок.

Водные рабочие растворы готовят в таких концентрациях: 0,15% фуксина кислого, 0,5 % эозина, 2% сафранина, 1-2% малахитовой зелени l-l,5% нейтральрота. Водные растворы большинства красителей нестойкие, и их применя­ют свежоприготовлеными.

Спитрто-водные растворы. Некоторые красители можно долго хранить в спир­товых растворах. В 100 мл 96%-ного этилового спирта в темной склянке с притepтой пробкой растворяют одну из красок основного фуксина 8,1 г, метиленовой сини 7 г, генцианвиолета 4,8 г. Для Лучшего растворения смеси выдерживают в термостате при 37⁰С и периодически встряхивают. Из этих растворов уже через сутки можно готовить рабочие разведения: на 1 объем краски берут 4-9 объемов дистиллированной воды. пользоваться такими рабочими растворами можно не более 1-2 дней.

Специальные растворы красителей с добавлением карболовой кислоты или едкого калия обладают большими красящими способностями и стойкостью, дольше хранятся.

Карболовый фуксин Циля. 1 г основного фуксина растирают в ступке спер­ва с 2-3 каплями глицерина, а затем тщательно перемешивают при постепенном добавлении 10 мл этилового спирта, 5 г карболовой кислоты и, наконец, 100 мл дистиллированной воды. Раствор сливают в склянку с плотной пробкой, помещают на сутки в термостат и фильтруют через бумажный фильтр (бумагу).

Для окраски кислотоустойчивых микробов, а также спор употребляют краску описанной рецептуры. Для окрашивания возбудителей вибриоза краску разводят 1:5 дистиллированной водой, а в других случаях – 1:10 (фуксин Пфейфера) непосредственно перед употреблением.

Карболовый генцианвиолет готовят, как фуксин Циля, с той лишь разницей, что карболовой кислоты берут не 5 г, а 2 г. Для работы используют 10%-ный водный раствор краски.

Метиленова синь по Лёффлеру. К 30 мл насыщенного спиртового, профильтрованного через бумагу раствора краски добавляют 100 мл дистиллированной воды и 1мл 1%-ного водного раствора едкого калия. Склянку плотно закрывают и выдерживают 1 месяц в термостате, после чего красящая способность синьки повышается, и появляются свойство окрашивать различные субстраты в разные цвет (метохромазия).

Краска Романановского – Гимзы: имеют в своем составе краски азур и эозин.

Выпускаются в продажу в виде готового основного раствора. Окрашивает раз­ные компоненты клеток (и бактерий) в зависимости от их реакции в синий или розовый цвет. Применяется для окрашивания ядерных элементов, волютиновых гранул и капсул. Непосредственно перед употреблением ее разводят 1:10-15 дистиллированной водой, лучше слабощелочной реакции (рН 7,2). Нa одно стек­ло с препаратами нужно 4-5мл разведенной краски.

При наличии сухой краски Романовского - Гимзы основной раствор ее готовят так: 3,8 г краски растворяют в 250 мл метилового спирта, добавляют 250 мл глицерина и перемешивают.

При отсутствии продажной краски Романовского - Гимзы аналогичную краску составляют на месте. Готовят отдельно 0,1 %-ные растворы азура II и эозина в свежепрокипяченной дистиллированной воде. Оба раствора в плотно закрытых флаконах темного стекла можно хранить длительно. Непосредственно перед употреблением растворы разводят (и смешивают) из расчета: по две капли каждой краски на 1 мл дистиллированной воды.

Краска по Ребигеру: 5-20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40%-ного формалина, отстаивают до следующего утра и фильтруют через бумагу. Хранят во флаконе темного стекла под резиновой пробкой.

Фуксин-синька по Муромцеву. Готовят растворы: а) 0,15 г основного фук­сина и 10 г кристаллической карболовой кислоты в 20 МЛ 96⁰-ного этилового спирта; б) 2,5 г метиленовой сини в 200 мл дистиллированной воды. Обе краски помешивают и фильтруют через два слоя бумаги. Хранят под притертой или ре­зиновой пробкой.

Раствор Люгоголя. 2 г йодида калия растворяют в 10мл воды; добавляют 1 г кристаллического йода 11 выдерживают несколько часов в термостате до пол­ного растворения йода; доливают дистиллированной воды до 300 мл и фильтру­ют через бумагу. Хранят во флаконах из темного стекла.

Красящие бумажки по Синеву. Ввиду быстрой порчи рабочих растворов красок взамен их широко пользуются красящими бумажками. Их приобретают в централизованном порядке или готовят на месте.

Пригодная для этой цели фильтровальная бумага должна отвечать следующим требованиям:

быть абсолютно чистой и на просвет однородной;

окрашиваются растворами красок равномерно, без пятен;

для проверки полоску бумаги проводят через краску, налитую в чашку Петри, высушивают на воздухе и осматривают в падающем свете;

быстро омачиваться дистиллированной водой и отдавать краску; красящую бумажку кладут на предметное стекло и наливают несколько капель дистиллированной воды;

вода должна быстро впитаться в бумагу и у ее краев интен­сивно окраситься.

Краску (приготовление см. ниже) наливают в тазик или в тарелку. Бумагу режут на ровные полоски 2Х50 см. Полоску держат пинцетом и погружают ее попеременно обеими сторонами в краску. Через 8-10 с полоску вынимают дают краске стечь и прикрепляют прищепками к веревке для высушивания при комнатной температуре. Сухие полоски режут на кусочки длиной 4,5 см или квадратные (2Х2 см) на один мазок. Хранят в закрытой коробке.

Приготовление, красок для пропитки бумажек.

1. Для окраски по Граму: 1 г генциан (кристалл- или метил-) виолета растворяют в 100 мл 96⁰-ного этилового спирта, добавляют 5 мл нейтрального глицерина, смешивают и фильтруют через бумагу. Хранят в темной, плотно за­крытой посуде.

2. Фуксина основного 2 г, спирта этилового 96⁰-ного 100 мл, глицерина нейтрального 1 мл. Готовят так же.

3. Карбол-фуксин Циля. К 100 мл обычно приготовленной краски прибавляют 2 мл нейтрального глицерина и перемешивают.

4. Метиленовой сини 1 г, спирта этилового 96⁰-ного 100 мл, глицерина нейтрального 1 мл. Готовят, как и раствор генцианвиалета.

5. Малахитовой зелени 5 г, воды дистиллированной горячей 100 мл, глицерина нейтрального 5 мл.

Приготовление мазков. Мазки (отпечатки) из экспертизного материала делают сразу же после посевов.

На чистых прозрачных, хорошо обезжиренных и профламбированных пред­метных стеклах с нижней стороны восковым карандашом обводят нужное число кружков размером с копеечную монету, не более трех на одном стекле, и мар­кируют их. В этом случае препараты можно будет фиксировать только над пла­менем или на мостике, наливая фиксатор на стекла. При наличии стекол с матовым шлифом по узкому краю маркировку условным порядком делают графит­ным карандашом на шлифе. Такие препараты можно фиксировать и в кюветах, после чего площадь каждого мазка с тыльной (стороны обводят восковым карандашом).

Мазки из органов. Поверхность органа в патологически измененном участке прижигают раскаленным шпателем. Стерильным скальпелем делают разрез, соскабливают немного пульпы и переносят в каплю физиологического раствора на запасном предметном стекле. Затем бактериологической петлей готовят сус­пензию и делают мазки.

Отпечатки из органов делают, прикладывая поверхность свежего среза к стеклу. Они должны быть тонкие, поэтому надо сперва получить пробные от­печатки на запасном стекле.

Мазки из крови. Кровь из сердца или нитрированную кровь из пробирки (после перемешивания) набирают пастеровской пипеткой. Небольшую каплю наносят на предметное стекло, не касаясь его пипеткой, остаток крови высе­вают в бульон и на косой агар (см. культивирование бактерий), после чего ка­пилляром той же пипетки, держа ее плашмя, делают из капли крови мазок.

Жидкую слизь, сперму набирают пастеровской пипеткой, наносят небольшую каплю на стекло и петлей делают мазок. Из огня и других полужидких материалов предварительно готовят суспензию, а из нее - мазки, Сгустки слизи и другие, плохо суспендируемые материалы наносят на предметное стекло ближе к краю и раздавливают их другим стеклом, передвигая его так, чтобы мазки образовались в сторону центров стекол.

Мазки из бульонных культур. Пробирку с культурой встряхивают для получения равномерной взвеси и берут в левую руку между большим и указа­тельным пальцами. Бактериологическую петлю берут, как карандаш, в первые три пальца правой руки и флам6ируют ее, проводя через пламя горелки, петлю нижнюю половину петледержателя. Мизинцем захватывают пробку пробирки и прижимают к ладони. Вблизи пламени, вращая, вынимают пробку, края пробирки выше, чтобы перекалить ее. Петлю охлаждают о стенку пробирки, забирают ею культуру и вынимают, не проводя через огонь. Быстро закрывают над пламенем пробирку и делают мазок. Капля должна равномерно, распределится в пределах отмеченного кружка. Мазок негоден, если культуральная жидкость не смачивают стекло, а собирается в отдельные капли.

Если из одной культуры нужно сделать несколько мазков, то культуру берут из пробирки пастеровской пипеткой и наносят каплю на запасное стекло, а из нее петлей делают мазки.

Мазки из агаровых культур. На чистое приметное стекло наносят каплю физиологического раствора. Из пробирки (чашки) с культурой вышеописанным порядком забирают петлей немного микробной массы и суспендируют в капле до появления помутнения. Остаток микробной массы сжигают на пламени, а мазок высушивают.

Чтобы получить менее густой мазок, готовят таким же способом суспензию на запасном стекле, а из нее делают петлей мазки размером в копеечную мо­нету, после чего стекло с суспензией опускают в дезинфицирующий раствор. Для люминесцентной микроскопии мазки делают из взвесей с малозаметным помутнением (100-200 клеток в поле зрения).

Для приготовления мазков из очень мелких колоний, выросших на чашках среди колоний посторонних микробов, вместо петли пользуются тонкой никелевой иглой, слегка загнутой на конце. Кончиком иглы осторожно забирают из центра колонии немного бактерийной массы, суспендирують ее в маленькой капельке физиологического раствора петлей делают мазки.

Все приготовленные мазки высушивают на воздухе.

Фиксирование мазков. Фиксирование делают для закрепления материала на стекле, обеспложивания микробов, а также дли лучшего окраши­вания тканевых клеток и бактерий.

Наиболее простая фиксация сухим жаром. Для этого стекло, держа мазком вверх, проводят над пламенем горелки 3-4 раза. При этом пальцы руки долж­ны хорошо чувствовать горячие ребра стекла, но не обжигаться. Фиксация жаром применяются для окрашивания по Граму, для выявления бактерий туберкулеза, волютиновых зерен и опор внутри бацилл и в некоторых других случаях.

Общеупотребительные способы фиксирования мазков из культур и из органов: метилотовый аппарат 5 мин, этиловый спирт 15 мин, смесь равных объемов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова) 10-12 мин. При работе с возбудителями особо опасных инфекций мазки фиксируют 4-5%-ным (по объему) раствором формалина в этиловом спирте 15 мин.

Фиксирование спиртами и формалинизированным спиртом ведут на мастиках или в кюветах, а жидкостью Никифорова - только в закрытых кюветах.

Для изучения тонкого строения бактерий мазки из культур фиксируют жидкостью Карнуа (смесь 96⁰-ного этилового спирта 50 мл, хлороформа 30 мл и ледяной уксусной кислоты 10 мл) В течение 15 мин. Если мазки предназначены для окраски по Романовскому, их надо промыть этиловым спиртом для удаления кислоты.

Окрашивание препаратов.

Простая окраска проводится одной какой-либо краской с целью определения формы микроба. Стекла с фиксированны­ми мазками помешают на мостике над сливной чашкой и покрывают рабочим растворам краски или погружают в кювет с краской. При наличии красящих бумажек их накладывают на мазки и наливают несколько капель дистиллированной воды так, что бы бумажка прилегла к стеклу, но не плавала на воде. Продолжительность окрашивания: фуксином Пфейфера, эозином, малахитовой зеленью 1-2 мин, синькой Леффлера - 3-5 мин. Затем краску сливают (или снимают бумажки) и стекла на мостике осторожно промывают дистиллированной водой, пока она не будет стекать бесцветной. Смывать краску можно и в кюветах, или стаканах, меняя воду до ее обесцвечивания. Препараты подсушивают осторожно между листами фильтровальной бумаги или на воздухе.

Лабораторный работник должен точно знать оптимальный режимы окрашивание при сложных методах окраски. Эти методы применяют для обнаружения капсул, спор, жгутиков а также для выявления способности микробов фиксировать некоторые краски, что имеет определенное значение при идентификации микробов.

Окраска по Граму. Все бактерии по отношению к этой окраске разделяют на грамположительные, окрашивающиеся генцианвиолетом в фиолетовый цвет, и грамотрицательные, обесцвечиваемые спиртом и воспринимающие дополнительную, контрастную (розовую) окраску.

На мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и наливают на нее рабочий раствор генцианвиолета. Если есть готовые бумажки, пропитанные этой краской, то их кладут на мазки матовой стороной вверх и наливают несколько капель воды. Через 2 мин бумажки снимают, краску сливают (не промывают) а на препарат наносят раствор Люголя на 1 мин (до почернения мазка), после чего раствор сливают, а мазок обесцвечивают этиловым спиртам до прекращения отхождения краски (около 30 с). Затем мазок промывают водой и, стряхнув воду, докрашивают мазок фуксином Пфейфера 30-60 с. или сафронитом 2 мин.

Надо строго соблюдать определенные сроки обработки препарата, особенно спиртом: при его передержке можно обесцветить и грамположительные микробы.

Отсканировать от окрашивание капсул и до окрашивание бруцелл.

подогрева 0,75 - 1%-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 1 мин, промывают и высушивают. Бруцеллы из молодых культур красные, другие мик­робы зеленые. В более старых культурах бруцеллы красятся, в оба цвета и промежуточно.

Окраска по Ш уляку - Шину. На фиксированный мазок наливают фуксин Циля в разведении 1: 5, выдерживают 2 мин без подогревания и промывают водой; докрашивают 2%-ным водным раствором метиленовой сини 5 мин и про­мывают водой. Бруцеллы ярко-красные, остальные бактерии сине-голубые.

Окраска по Ганзену. Готовят растворы красок: а) 30 мл насыщенного спир­тового раствора метиленовой сини смешивают со 100 мл 0,04 %-ного раствора едкого калия (его получают путем прибавления 4 мл 1%-ного водного раствора едкого кали к 96 мл дистиллированной воды); б) 0,9 г сафранина растворяют в 30 мл дистиллированной воды, полученный 3%-чый pacтвop подогревают до кипения и фильтруют через бумагу (готовят перед употреблением). Делают тонкие мазки из содержанию желудка, внутриполостных экссудатов и паренхи­матозных органов абортированных плодов. Суспензии готовят в физиологичес­ком растворе (не в дистиллированной воде!). Препараты высушивают на воз­духе, можно при легком подогревании над пламенем.

даже при незначительном помутнении заменяют запасными.

Окрашивают спиртово-щелочным раствором метиленовой сини 1 мин и про­мывают дистиллированной водой. Докрашивают 3%-ным раствором сафранина 15-20 г, промывают и осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Бру­целлы синие, другие бактерии и фон препарата - красные.

Окраска по Кюстеру. Высушенный препарат фиксируют над пламенем. Ок­рашивают щелочным раствором сафранина 1 мин и тщательно промывают. Об­рабатывают 0,05%-ным раствором серной кислоты 15 г (дифференцирующая протрава) и тщательно промывают. Дополнительно окрашивают мазок 3%-ным водным раствором метиленовой сини 15-20 г и промывают. Бруцеллы крас­ные, посторонние микробы синие.

Состав основной краски: 5 капель свежеприготовленного 3%-ного водного раствора сафранина перед употреблением смешивают с 1,5 мл нормального раствора едкого кали (5,6 г КОН на 100 мл дистиллированной воды).

Окраска по Стемпу (модифицированный метод Циля-Нильсона). Мазок фиксируют над пламенем и окрашивают фуксином Пфейфера 1О мин, слетка промывают водой и обесцвечивают 0,5%-ной уксусной кислотой 30 г. Тщатель­но промывают и докрашивают 1%-ным раствором метиленовой сини 20-30 с и вновь промывают. Бруцеллы красные, другие бактерии - синие.

Окраска возбудителя гемофилезнаго полисерозита свиней по Гинсу. Черную тушь разводят 1: 3 дистиллированной водой, тщательно встряхивают и центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. Центрифугат туши отсасывают, разливают в пробирки, стерилизуют при 1 ати 30 мин и хранят под резиновыми пробками.

На предметное стекло наносят каплю туши, суспендируют в ней петлей не­много исследуемой агаровой культуры и с помощью капилляра пастеровской пипетки или шлифованного стекла делают мазок (см. Микроскопические иссле­дования. Мазки из крови). После высушивания мазок фиксируют метиловым пли этиловым спиртом 3-5 мин, окрашивают карбол-фуксином Циля, разведен­ным 1: 3 дистиллированной водой, промывают и микроскопируют. Палочки и нитевидные формы микроба красные, окружены узкой светлой зоной (капсула) фон мазка темный.

Окрашивание кислотоустойчивы микробов. Эти бактерии окрашиваются карболовыми растворами фуксина и других сильных красите­лей. Зато их в отличие от других микробов трудно обесцветить спиртами и кис­лотами. На этих свойствах и основаны способы дифференциальной окраски возбудителей туберкулеза и других микобактерий позволяющие их от посторонних микробов.

Окраска по Цuлю - Нильсену. Мазок фиксируют над пламенем, накрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый фуксии Циля и нагревают с появлением паров 3-5 мин, периодически проводя стекло над пламенем, но не доводя до кипения; при этом надо доливать краску на мазок, Препарату дают остыть, удаляют бумажку, промывают водой; обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты……….