Кожный эквивалент и принципы восстановления эпителиально-стромальных дефектов

Принципиальная возможность культивирования клеток кожи была впервые показана в работах Р. Medawara. В 1968 году был разработан метод трансплантации первичных культур эпидермальных кератиноцитов в эксперименте.

Однако возникли трудности при выращивании клеток в больших масштабах, что было необходимо для закрытия ран. Новый импульс в решении этой проблемы был дан работами J. Rheinwald и H. Green (1975), которые достигли большого прогресса в получении больших по площади пластов культивированных клеток, используя облученные мышиные фибробласты в качестве фидерного слоя.

Попытки культивирования кератиноцитов на поверхности живых фибробластов не могли увенчаться успехом из-за выраженной неприхотливости последних (бурной их пролиферации или быстрого вытеснения кератиноцитов из культуры). Появилась необходимость найти субстрат, позволяющий:

1. изолировать фибробласты от непосредственного контакта с эпидермальными клетками и в тоже время

2. сохранить их стимулирующие влияние на рост эпителия.

Наиболее физиологичным явился трехмерный коллагеновый гель, позволивший моделировать те условия, в которых они находятся в организме. Добавление культивированных фибробластов дермы в 3-х мерный коллагеновый гель привело к созданию in vitro «живого эквивалента дермы».

Технология получения эквивалента кожи включает 4 этапа:

1. Предварительная подготовка и соединение основных (клеточного и внеклеточного) компонентов дермы при рН - 7,4;

2. Тщательное перемешивание и перенесение в культуральную посуду и образование коллагенового геля с заключенными в него фибробластами в результате полимеризации коллагена;

3. Дальнейшее упорядочивание коллагенового геля во время инкубации и образование эквивалента дермы;

4. П олучение эквивалента кожи в результате внесения суспензии кератиноцитов и их культивирования на поверхности дермального эквивалента.

Установлено, что именно фибробласты определяют направленность и исход процессов восстановления структуры ткани.

В результате клинического применения дермального эквивалента при лечении гранулирующих ран и трофических язв было установлено стимулирующее влияние фибробластов на течение раневого процесса (сокращение сроков эпителизации, формирование нежных грануляций), в том числе и в условиях инфицированной раны.

Таким образом, относительная простота и дешевизна получения дермального эквивалента и получения культур фибробластов позволили начать их применение в клинической практике:

1. фармакология (при доклинической апробации лекарственных средств);

2. косметология (при апробации косметических средств);

3. токсикология, дерматология (при различных инфекционно- аллергических заболеваниях кожи);

4. хирургия и травматология (при заживлении ран и трансплантации кожи).

Инженерная энзимология прикладная энзимология

В современной БТХ одно из центральных мест принадлежит ферментам (Е). Всё живое содержит Е и без них невозможен обмен веществ. Возможность препаративного получения ферментов позволило использовать их в различных областях народного хозяйства: промышленности (пищевой, производство ПАВ (моющих и косметических средств), текстильной, бумажной, кожевенной, фармацевтической и т.д.); Сельском хозяйстве, а также в научных исследованиях (медицине, тонком органическом синтезе, химическом анализе).

Применение ферментов позволило изменить технологические процессы, методы анализов, обеспечить более высокие показатели продуктивности и качества производства.

В отличие от многих технологических процессов химические технологий, требующих высоких величин P, t, pH-среды, ионной силы, биотехнологий производства с применением ферментов осуществлялось с меньшими энергозатратами и в более «мягких» условиях:

1. При t не более 60 ⁰С;

2. Нормальным атмосферным давлением Р;

3. рН среду 4,5-8,0;

4. Ферменты обладают высокой субстратной, специфичностью к обратимости биохимических реакций.

В связи с этим, не удивительно, что начиная с середины XIX в. получение ферментов и их использование в различных технологических процессах составляет один из важнейших разделов БТХ. Только за период 1965-1980 г. ферментативная промышленность в ведущих странах мира увеличила объем производства в среднем на 15%.

Принципиально новые перспективы перед прикладной энзимологией открыты в результате создание нового типа биоорганических катализаторов – гетерогенных катализаторов, так называемых иммобилизованные ферменты, т.е. ферменты, связанных с носителем и несколько позднее было получена возможность производства гетерогенных катализаторов на основе клеток.

Продукт	Примеры	Применение в пищевой промышленности
Аминокислоты	Цистеин, метионин, лизин	Повышение питательной ценности пищи (в том числе белка одноклеточных)
	Глутамат	Усиление аромата мясных, рыбных, грибных изделий
	Глицин, аспартат	Придание кондитерским изделиям и напиткам кисло-сладкого вкуса
Олигопептиды	Аспартам, тауматин, монеллин	Низкокалорийные, очень сладкие вещества
Ферменты	α-Амилаза	Гидролиз крахмала при производстве спирта, вин, в пивоварении, хлебопечении, изготовлении кондитерских изделий и детского питания
	Глюкоамилаза	Получение глюкозы, удаление остаточных декстринов из пива
	Инвертаза	Производство кондитерских изделий
	Пуллуланаза	Производство мальтозных (в сочетании с α-амилазой) или глюкозных (в сочетании с глюкоамилазой) сиропов из крахмала, предварительно обработанного α- амилазой
	Β-Галактози-даза	Производство безлактозного молока, освобождение молочной сыворотки от лактозы, приготовление мороженого
	Целлюлозы	Приготовление растворимого кофе, морковного джема, улучшение консистенции грибов и овощей, обработка цитрусовых
	Пектиназы	Осветление вин и фруктовых соков, обработка цитрусовых
	Микробные протеазы	Сыроварение, ускорение созревания теста, производство крекеров
	Пепсин, па-паин	Осветление пива
	Фицин, трипсин, бромелаин	Ускорение маринования рыбы, удаление мяса с костей
	Липазы	Придание специфического аромата сыру, шоколаду, молочным продуктам, улучшение качества взбитых яичных белков
	Глюкозооксидаза в сочетании с каталазой	Удаление кислорода из сухого молока, кофе, пива майонезов, лимонных, апельсиновых и виноградных соков
Витамины	А, В1, В2, В6, В12, С, D, Е, никотиновая кислота С, Е	Повышение питательной ценности пищевых продуктов Антиоксиданты
Терпены и родственные соединения	Гераниол, нерол	Ароматизаторы
Органические кислоты	Уксусная, бензойная, молочная, глюконовая, лимонная	Консерванты, ароматизаторы

Таблица 1. Перспективы использования биотехнологических продуктов в пищевой промышленности (по П. П. Клесову, 1984; М. Haas, 1984; J.Kas, 1984; O. Volfova, 1984; O. Sahai, M. Knuth, 1985)