Клеточные технологии

Использование клеток, выделенных из различных органов и тканей человека, для лечения заболеваний получило название «регенераторная медицина».

В регенераторной медицине условно можно выделить 2 направления:

1. клеточная инженерия;

2. тканевая инженерия.

Клеточная инженерия основывается на выделении определенных типов клеток, придание им in vitro с помощью генетических конструкций или ряда «сигнальных» молекул специфических свойств и введения их в организм больного.

Наиболее успешными направлениями клеточной инженерии являются:

1. Использование дендритных клеток для модуляции иммунного статуса;

2. Использование стволовых клеток как инструментов для генной терапии;

3. Создание технологий гибридизации половых и соматических клеток, где наиболее удачным в коммерческом отношении является производство моноклональных антител (МАТ).

Однако появление и развитие этих направлений стало возможным только, при развитии метода культуры клеток (культивирование животных клеток).

Начало методу культуры клеток тканей было заложено в 1907 году. Экспериментом, который должен был внести ясность в дискуссию, происходившую среди нейробиологов. Гипотеза, правильность которой необходимо было проверить, получила название нейронной доктрины и сводилась к следующему: каждое нервное волокно образуется, вырастая из одной нервной клетки, а не путем слияния многих клеток.

Для решения этого вопроса небольшие участки спинного мозга помещали в теплую влажную камеру и наблюдали под микроскопом через равные промежутки времени. Примерно через сутки (24 часа) можно было увидеть, что от отдельных нервных клеток начинают отходить длинные тонкие отростки, что свидетельствовало в пользу нейронной доктрине, и был заложен фундамент для переворота, происшедший в клеточной биологии в результате применения метода культивирования клеток.

Основополагающие эксперименты, проведенные в 1907 г. включали использование небольших фрагментов ткани или эксплантов. В настоящее время клеточную культуру обычно выращивают в клеточной суспензии, полученной путем диссоциации ткани. Основное преимущество таких диссоциированных культур состоит в потенциальной возможности выделения из смеси различных клеток, отдельных типов клеток, их исследования и последующего клонирования.

Клон – получение идентичных потомков клетки (молекулы) при помощи бесполого размножения.

Культура, приготовленная, непосредственно из тканей организма – первичная культура.

Большинство клеток многоклеточного организма, в отличие от бактериальных органов не способны расти in vitro. Установлено, что способность клеток к культивированию находится в обратной зависимости от степени их дифференцировки и специализации. Хорошо поддавались культивированию фибробласты, другие мало дифференцированные клетки – предшественники, стволовые клетки, эмбриональные клетки, раковые клетки. Мышечные или нервные клетки, лимфоциты в культуре не размножались.

Часто эти клетки сохраняют признаки дифференцировки исходных тканей:

• фибробласты способны секретировать коллаген;

• миоциты эмбриональных тканей способны сливаться, и образуют спонтанно сокращающиеся гигантские мышечные волокна;

• нейроны формируют аксоны, обладающие электропроводимостью и способностью образовывать синапсы с другими нервными клетками;

• эпителиоциты, склонны к формированию больших слоев, сохраняющих свойства интактного эпителия.

Большой вклад в развитие методологии культуры животных клеток внесли работы Алексиса Карреля (1912) и А. Эбелинга (1913), постулировавших гипотезу «соматического бессмертия клеток» многоклеточного организма. Они культивировали фибробласты сердца цыпленка вне организма (in vitro) в стерильных условиях и отмечали, что после небольшого латентного периода начинается рост экспланта ткани, т.е. клетки мигрируют из тканей в питательную среду и делятся. Исследователи пересаживали клетки из одной среды в другую (т.е. применялась методика «пассирования» или субкультирования) и культура возобновлялась десятки лет.

Однако Э. Свимом (1956), а затем в 1965 году Хейфликом концепция Карреля была радикально пересмотрена и экспериментально опровергнута.

Хейфлик усовершенствовал методику «пассирования» Карреля, которая в настоящее время выглядит следующим образом:

В настоящее время установлено, что клетки всех клеточных культур можно классифицировать на 3 основные клеточные линии:

1. Первичные клетки (образовавшиеся сразу после диссоциации ткани и несущие все признаки исходной ткани);

2. С ограниченным пролиферативным потенциалом (смертные или мортальные клетки) для которых характерно:

1. ограниченное число делений 50 ± 10;

2. имеют кариологическую картину ткани, из которой происходят;

3. зависят от прикрепления при их культивировании;

4. не вызывают опухоли при введении экспериментальным животным.

3. Иммортальные (бессмертные) линии клеток, которые;

1. смогли избежать кризиса - состояния терминальной остановки пролиферации;

2. могут вызывать опухоли, после введения лабораторным животным;

3. не имеют кариологическую картины клеток исходной ткани;

4. не зависят от прикрепление при их культивирование.

Пролиферация клеток I-ой и II-ой линий in vitro по Хейфлику выглядит следующим образом.

1 фаза – роста – время от момента посева до образования 1-го монослоя;

2 фаза – период активного деления (с субкультивированием);

3 фаза – деградации культуры (для мортальных клеток);

3’ фаза – неограниченная пролиферация (для иммортальной культуры).

Гипотеза о потенциальном «бессмертии» соматических клеток Карреля очевидно основана на моноклональном использовании иммортальных клеток при субкультивировании.